凱氏定氮法測粗蛋白的實驗步驟和注意事項

　　食品中蛋白質含量的多少是評價糧油食品品質、營養價值的重要指標。測定某些糧食蛋白質的含量，可以做到充分發揮糧油資源的作用，促進合理用糧，節約用糧，對提高糧油資源的利用率具有重要的意義。

　　以凱氏定氮法為代表的測定含氮量換算蛋白質的方法操作簡單、測定結果的準確度和精密度較高，適宜于測定任何形態（固體、液體）的樣品，是蛋白質總量測定的經典之一，迄今為止一直作為國內外法定的蛋白質測定方法，就是凱氏半微量定氮法，適用于糧食、油料中粗蛋白的測定，大豆中蛋白質溶解比率的測定。

　　為了使初學者在操作過程中減少失誤，提高試驗的成功及測定結果的準確度，本人將自己在實驗操作過程中的經驗，應注意的幾個問題，介紹給大家，僅供參考。

　　1 原理

　　樣品與濃硫酸共熱時，有機物被分解、脫水、炭化。炭化生成的碳與硫酸作用生成二氧化碳和具有還原性的二氧化硫；二氧化硫使蛋白分解后產生的氮還原為氨氣，本身則氧化為三氧化硫。

　　消化過程生成氫，促進并保證了氮到氨氣的轉化，避免了氮的損失。消化反應生成的三氧化硫、二氧化碳和水因加熱而不斷揮發逸失，生成的氨氣則以銨鹽的形式留在消化液中，這樣完成了有機氮到無機銨鹽的轉化。硫酸鉀和硫酸銅分別用于提高消化液溫度和催化有機物的消化分解。

　　當消化液堿化后，溶液中銨鹽轉化為氨氣逸出，使氨與其他雜質分離，同時用硼酸溶液吸收氨，水蒸氣蒸餾使消化液中氨完全轉移到硼酸溶液中。用鹽酸標準溶液滴定硼酸溶液中的氨，以測定樣液中的總氮量，由總氮量乘以蛋白質系數換算為蛋白質含量J反應式。

　　2 器具與試劑

　　2.1 器具 凱氏燒瓶：平底燒瓶：（標準書上為圓底燒瓶）；平底燒瓶加熱時增加受熱面積，提高儀使用穩固程度；萬用電爐；錐形燒瓶（備塞及打孔機）微量滴定管：全自動定氮儀：容量瓶：移液管：量筒：洗耳球、凱氏微量蒸餾裝置、膠管等。

　　2.2試劑

　　全部試劑應是無氮化合物，其純度為分析純，水應是蒸餾水。

　　濃硫酸--- 過氧化氫--- 水混合液比例 （體積比），在水中緩慢加濃硫酸），冷卻后再加入“過氧化氫”混勻備用。有些標準書誤印混合液的比例（體積比），配用時一定要當心體積比。此溶液可在陰涼處放置3個月；混合催化劑：稱取硫酸銅、硫酸鉀、硒粉，混合后在研缽中研磨并通過目篩，混合后備用；氫氧化鈉溶液；硼酸溶液 （標準書上有用）濃度，有用度，本人認為濃度，用時量取體積約鹽酸溶液；混合指示劑：稱取（2甲基紅置于研缽中，加入少許乙醇，研磨溶解后加入乙醇；稱取（ 2次甲基藍溶于：乙醇溶液；臨用時，將以上兩溶液按）：體積比混合，該指示劑在酸性域為紫紅色；在；1為時，呈無色；在堿性域為綠色。

　　3 試樣制備與測定方法

　　3.1試樣制備

　　選取有代表性的試樣，用四分法縮減，粉碎后全部通過目篩，裝于密封容器中備用。

　　3.2測定方法

　　消化試樣用量，若糧食作物，一般是，若油料或餅渣應是2.即保證試樣粗蛋白含量，減少因粗蛋白含量不同，所用試劑量、反應時間有差異，而影響定結果的重現性。

　　為保證試樣稱量準確，先把凱氏燒瓶烘至恒重（精確到），用蠟光紙卷著，根據試樣用量已粗稱過的樣品，緩緩伸進凱氏燒瓶底部并倒入，輕輕取出蠟光紙，然后再稱出凱氏燒瓶增加的重量即試樣重。標準書上直接用蠟光紙稱樣品倒入凱氏燒瓶，有時樣品不能干凈轉移，有時為了干凈轉移樣品，要輕彈蠟光紙，而使少部分試樣濺到凱氏燒瓶的上中部壁上，濃硫酸--- 過氧化氫--- 水混合液不易浸泡到，加熱不易消化，而使測定結果偏低。

　　試樣準確稱量后，向凱氏燒瓶中加入混合催化劑2（提高硫酸沸點，使消化的速度加快，而不是標準書中誤寫 “加入混合指示劑2”,否則消化緩慢，消化終點也不是淺藍綠色的透明狀），同時加入濃硫酸--- 過氧化氫--- 水混合液，稍加振搖，集中浸泡試樣，斜置于電爐上，在通風櫥內加熱進行消化。開始時用低溫加熱，勿使瓶中泡沫超過瓶肚的），待泡沫減少和煙霧變白后再增加溫度保持微沸。消化到溶液呈淺藍綠色的透明狀時，再繼續加熱沸騰，取出待消化液冷卻至室溫后，加水，再待溶液溫度降到室溫后，干凈地轉入容量瓶中（用少量水將凱氏燒瓶沖洗），加水稀釋至刻度，混勻備用（消化液加水稀釋后，應及時進行蒸餾，否則應保存消化液，臨用時加水稀釋）。