動物免疫實驗

實驗概要

將某種蛋白注射新西蘭大耳兔產生免疫反應，通過ELISA檢測免疫產生的抗體。

實驗原理

將抗原吸附在固相載體表面，加入抗血清，抗體和抗原在載體表面形成抗原-抗體復合物，洗去未結合抗體，然后加入辣根過氧化物酶標記的二抗（抗體的抗體），二抗與抗體結合，洗去未結合二抗，加底物顯色劑顯色，在一定波長下測定  OD 值，根據 OD 值判斷血清中抗體的產生情況。

主要試劑

PBS 緩沖液

弗氏完全佐劑

弗氏不完全佐劑

碳酸鹽緩沖液

辣根過氧化物酶標記的羊抗兔 IgG 二抗稀釋液

TMB 底物溶液 A 液與 B 液

主要設備

研缽

注射器

兔固定架

錐形瓶

酶聯板

洗板機

酶標儀

實驗材料

新西蘭大耳兔（公）

實驗步驟

1. 抗原的乳化

    以無菌 PBS 緩沖液溶解抗原，使總蛋白的濃度為 2 mg/mL，將弗氏完全佐劑與抗原溶液以 1∶1 比例混合，在干凈無菌的研缽內研磨，直至形成穩定的油包水型乳劑（一小滴乳劑在水面上不擴散）。

2. 初次免疫

(1)    獲得陰性血清

免疫前，耳緣靜脈采血約 2 mL。置 37℃ 1 h，4℃靜置過夜使血清析出，離心（2000 r/min，4℃，10 min），吸取上清，分裝后 -80℃保存。

(2)    注射

用弗氏完全佐劑乳化的抗原溶液，在兔背部、大腿處進行皮內、肌肉多點注射。皮內注射：每處約 0.1 mL，共注射 20-30處；肌肉注射：每點 1 mL，兩點注射。注射完畢，輕輕按摩注射部位以幫助吸收，注射位置出現白色小皮丘。

3. 加強免疫

一周后，用弗氏不完全佐劑乳化的抗原進行加強免疫，過程同初次免疫。每隔一周，以 PBS溶解的抗原（總蛋白濃度為 2 mg/mL）加強免疫一次。

免疫 4 次后，間接 ELISA 法測定抗血清效價上升情況。

4. 抗血清的制備

(1)    血清中抗體的效價上升且達到穩定值后，加強免疫一次，一星期后可采血獲得大量抗血清；

(2)    采血前保證飲水，但停食一天，以降低血脂；

(3)    將大耳兔用兔固定架固定；

(4)    心臟采血，采血后的注射器需靜置，以免發生溶血現象；

(5)    將采得血液 37℃靜置 1 h，4℃過夜，離心（3000 r/min，4℃，10 min），吸取上清，分裝為不同體積，-80℃保存備用。

5. 間接 ELISA 測定

(1)    以包被液（碳酸鹽緩沖液）包被抗原溶液，使對應抗原終濃度為 0.5 μg/mL；

(2)    在酶聯板的每孔中加入 100 μL 抗原包被液，處理及對照包括：

抗原包被液＋一抗＋二抗

抗原包被液＋二抗

輕輕振動平板使抗原分布均勻，將包被的微量滴定板用塑料保鮮膜封好，37℃潮濕孵育 60 min，再置 4℃過夜；加有抗原溶液的微量滴定板封好后于 4℃可保存數月。

(3)    次日，在洗板機上用 PBST 洗滌三次；

(4)    每孔加入 150 μL~200 μ L封閉液，37℃潮濕孵育 60 min；

(5)    倒掉封閉液，用 PBST 洗滌三次，最后每塊滴定板用一大紙巾包裹，孔口朝下，在幾張紙巾上輕輕拍打，棄去殘余的液體；

(6)    用稀釋液將抗血清做 1∶20、1∶40、1∶80、1∶160 稀釋，取 100 μL 分別加入到對應包被孔中，微量滴定板用塑料保鮮膜封好，37℃潮濕孵育 60 min；

(7)    洗板機上用 PBST 洗滌三次，最后一次洗滌后，如步驟 5 所述棄去殘余液體；

(8)    每孔中加入 100 μL 辣根過氧化物酶標記的羊抗兔 IgG 二抗稀釋液（1∶10000 稀釋），37℃潮濕孵育 60 min，洗滌三次；

(9)    混合 TMB 底物溶液 A 液與 B 液，每孔加入 50 μL，37℃顯色 15~30 min；

(10)  每孔中加入 50 μL 2 mol/L H₂SO₄ 終止反應；

(11)  酶標儀上測定 OD₄₅₀ 值。