雙抗體夾心ELISA法檢測待測樣品sTNFα的含量

實驗概要

本實驗利用雙抗體夾心ELISA法檢測了待測樣品sTNF-α的含量。選用兩株針對TNF-α分子不同位點的單克隆抗體，即McAb₁(包被抗體)與McAb₂(酶標抗體)。先用McAb₁包被固相載體，使待測sTNF-α與之特異性結合，然后再加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的McAb₂，則形成McAb₁-sTNF-α -HRP標記McAb₂復合物，再加入HRP底物，則酶催化底物顯色，測定樣品與標準品光密度值(即OD值)，繪制標準曲線，即可從標準曲線中查得待測樣品中sTNF-α含量。

主要試劑

1. 包被抗體McAb₁：使用時用包被液作適當稀釋(如1：100)。

2. 酶標抗體McAb₂：以辣根過氧化物酶(HRP)標記。使用時用稀釋液作適當稀釋，其稀釋度根據預試驗結果而定。

3. rhuTNF-α標準品：已知含量的rhuTNF-(10ng/ml)，使用時用稀釋液作倍比稀釋成7個濃度：5 ng/ml，2.5 ng/ml，1.25 ng/ml，625pg/ml，312 pg/ml，156 pg/ml，78 pg/ml。

4. PBS(0.01mol/L，pH7.4的磷酸鹽緩沖液)

5. 包被液(0.05mol/L，pH9.6碳酶鹽緩沖液)

6. 洗滌液(0.05%Tween-20-PBS)

7. 稀釋液(含2% PEG的洗滌液或含10% BSA的PBS)：稀釋液主要用來酶標McAb₂和標準品rhaTNFα。2% PEG洗滌液的配制：2.9g Nacl，2.0g PEG(MW6000)，0.6ml雞蛋清溶于100ml PBS中。

8. 底物緩沖液(0.1mol/L，pH5.0的檸檬酸鹽緩沖液)：稱取1.79g Na₂HPO₄·12H₂O和1.29g檸檬酸，溶解至100ml雙蒸水。

9. 底物液(顯色液)：將5mg ABTS或10mg OPD 溶于 10ml底物緩沖液中，加入20μl 3% H₂O₂(臨用前配制)。

10. 終止液(2mol/L的H₂SO₄)：量取20ml 98% H₂SO₄ ，緩緩加至80ml雙蒸水中即可。

主要設備

1. 96孔酶標板(96孔ELISA板)，酶標測定儀，495nm濾光片。

2. 其他：4℃冰箱，水浴箱，刻度吸管，毛細吸管，加樣器(頭)等。

實驗材料

1. 待測樣品：如血清、血漿、尿液、細胞培養上清液等均可用于sTNF-α，后者應作適當稀釋。

2. 陰性對照品：未免疫小鼠IgG。

實驗步驟

1. 包被：將用包被液稀釋好的McAb₁加入96孔酶標反應板，100μl /孔，置37℃溫育2h后再移置4℃過夜(16-72h)；

2. 洗滌：將96孔酶標板傾去包被液，用洗滌液加滿各孔，置室溫3min，然后傾去。反復洗滌3次。

3. 加樣(均設雙復孔)。

   1) 將已知含量rHuTNF-α標準品用稀釋液作倍比稀釋后，分別加入1～7孔，100μl/孔，按濃度從低到高的順序依次加樣；

   2) 8孔加入待測樣品，100μl；

   3) 9孔加陰性對照血清(未免疫小鼠IgG)，100μl；

   4) 10孔為空白對照(稀釋液)，100μl/孔；

4. 加樣后，置37℃孵育1～2h。洗滌3次，方法同前；

5. 各孔加入HRP標記的McAb₂，用稀釋液作適當稀釋，其稀釋度根據預試驗結果而定，100μl/孔；

6. 置37℃孵育1～2h；

7. 洗滌3次，方法同前；

8. 顯色：各孔加新鮮配制的ABTS顯色液(或OPD-H₂O₂顯色液)，100μl/孔，置室溫或37℃下避光反應15-30min

9. 終止反應：各孔加入終止液2mol/L H₂SO₄，50μl/孔；

10. 測定OD值：用酶標測定儀，以波長495nm測定各孔OD值。

注意事項

1. 血清或血漿中殘存的凝塊或紅細胞須經離心去除，匆用溶血或血脂過多的血清檢測TNF-α含量。

2. 待測樣品在2-8℃可放置3d，超過3d應放入-20℃或-70℃冰箱，且應避免反復凍融，宜分裝保存。

3. TNF-α標準品的質量直接影響待測樣品結果的準確性，應注意商品試劑盒中的標準品可隨時間延長而效價降低。

4. 分別用加樣器頭吸取各份標本，避免相互交叉使用。

5. 疊氮鈉(NaN₃)對辣根過氧化物酶有滅活作用，在本實驗系統中應避免使用。_--

6. 底物顯色液應在臨用前配制，置4℃避光保存，H₂O₂應置2-8℃，保存6個月以內。加入底物顯色15-30min后應立即測定OD值。

7. 應避免反應孔中有氣泡，以免影響所測OD值的準確性。

8. 用不同來源的樣品、不同實驗室所測得的TNF-α含量不同，正常值標準也難于統一。可進行大樣本測定，以X  2SD確定自己實驗室各種來源檢測樣品的TNT-α正常值范圍。一般ELISA法測定血清標本時，TNF-α參考值范圍為4.3  2.8μg/L(或4.3 2.8ng/ml)。