大觀霉素間接競爭性ELISA的建立及應用

大觀霉素（spectinomycin，SPE）是一種氨基糖苷類廣譜抗生素，是Mason于1961年首次從鏈霉菌中分離得到^[1]。從結構上講，氨基糖苷類抗生素分子中均含有氨基糖苷結構。而SPE（圖1）是一種氨基環醇類抗生素，沒有氨基糖苷結構，但在許多文獻資料中SPE都被歸為氨基糖苷類藥物。在臨床中，SPE多采用鹽酸大觀霉素的形式，是常用的治療豬的細菌性腸炎和雞的呼吸道疾病的口服藥^[2]。SPE常被用作畜禽飼料添加劑，用于治療和預防疾病。與其他抗生素一樣，SPE在畜禽養殖中被嚴重濫用，在動物體內蓄積，并通過食物鏈傳遞給人類，相當于長期低劑量的服用SPE，導致肌體內細菌的耐藥性增加，進而破壞肌體的提抗力，引發過敏反應、聽神經損害等。農業部“235”號公告明確規定了大觀霉素在動物性食品中的殘留限量為500 μg/kg，在牛奶中不得超過200 μg/L^[3]。GB 29685-2013規定檢測動物性食品中大觀霉素的方法是GC/MS ^[4]。

圖1大觀霉素化學結構式

Fig. 1 The chemical structure of spectinomycin

建立大觀霉素殘留快速檢測方法具有重要意義。本研究在前期抗原抗體制備的工作基礎上^[5]，建立了SPE的ELISA檢測體系及其在動物源性食品中殘留的檢測方法，基于此項研究工作開發的檢測試劑已實現商品化。

1 材料與方法

1.1試劑

大觀霉素、慶大霉素、新霉素、卡那霉素、雙氫鏈霉素、鏈霉素購自中國藥品與生物制品鑒定所，羊抗兔酶標二抗、牛血清白蛋白（BSA）、Proclin 300、明膠、Tween-20、酪蛋白等購自sigma 公司；ELISA酶標板，深圳金燦華；新生牛血清購自北京元亨生物；其他分析純化合物均購自北京國藥集團。大觀霉素包被抗原、大觀霉素多克隆抗體由本公司制備。

ELISA所用的緩沖溶液：

（1）包被緩沖液：0.05 M碳酸鹽緩沖液，pH 9.6；

（2） 磷酸鹽緩沖液（0.02M，PBS）：1000 mL 0.01M PB緩沖液中加入8.5 g NaC1，0.02 g KCl，pH 7.4；

（3）洗滌液：1000 mL PBS加入0.5 mL Tween-20；

（4） 酶稀緩沖液：2 mL Tween-20、1 g明膠、200 mL新生牛血清（使用前56℃滅活30 min）、0.2 g酪蛋白和300 μL ProClin 300，加入到0.02 M PBS中，定容到1000 mL；

（5）封閉液：1000 mL PBS加入2.5 g酪蛋白、3%BSA、5%蔗糖和300 μL ProClin 300；

（6）抗體稀釋液：0.01M PBS中加入300 μL ProClin 300、200 μL Triton 100、0.1% BSA，定容到1000 mL。

1.2 儀器

MK3酶標儀（美國，Thermo fisher公司）；TDL-40C離心機（上海安亭科學儀器廠）；HQ-60型渦動儀（北京方正生物科技發展有限公司）；電子分析天平（德國，賽多利斯科學儀器公司）；Milli-Q型超純水儀（美國，Milli-Q 公司）；微量移液器（德國，Eppendorf公司）；SH-2 微孔板脫水儀（北京雙和盛源科技發展中心）。

1.3 方法

1.3.1 建立大觀霉素的標準抑制曲線  

首先，用方陣法篩選包被抗原、抗體的工作濃度，并對包被方式、加樣體系進行選擇，然后建立SPE的icELISA標準曲線：

（1）包被：根據方陣法確定的濃度稀釋包被抗原，每孔100 μL，4℃過夜包被（16h），棄包被液，洗滌一次；

（2）封閉：在每孔中加入150 μL封閉液，室溫下封閉2 h，棄封閉液，甩干；

（3）干燥：將甩干后的酶標板倒扣至于37℃恒溫箱中，干燥1 h。

（4）加樣：將50 μL不同濃度的SPE標準品平行加入微孔中，標準品濃度設置為：0，0.2，0.6，1.8，5.4，16.2 ng/mL。然后順序加入50 μL酶標二抗工作液、50 μL SPE抗體，室溫下（25±2℃），避光反應30 min，洗滌四次；

（4）顯色：在每孔中加入按照同樣比例剛混合的底物液100 μL，避光孵育8-10 min；

（5）讀數：每孔加入50 μL終止液終止，5 min內在450 nm/630 nm 雙波長下讀出數據；

以SPE標準品濃度的對數為橫坐標，不同濃度的SPE標準品的結合率為縱坐標，用軟件Origin8.0繪制標準曲線，建立四參數回歸方程。回歸方程如下：

其中Y為結合率，A₁代表最低濃度標準品的結合率，A₂是最高濃度標準品的結合率，P為曲線拐點的斜率，X₀為IC₅₀。

1.3.2 抗體的特異性 

以icELISA法分別考察SPE抗體與氨基糖苷類抗生素：慶大霉素、新霉素、卡那霉素、雙氫鏈霉素、鏈霉素的交叉反應，建立上述藥物的標準抑制曲線，并計算各自的IC₅₀，按下式計算交叉反應：

交叉反應(CR％)=IC₅₀(SPE)／IC ₅₀(有關化合物)×100％

1.3.3  樣本分析

1.3.3.1 牛奶樣本

準確量取0.1 mL牛奶樣品于2 mL離心管中，加入0.9 mL 含0.01% Tween-20的去離子水，慢速渦動混勻后取50 μL進行檢測。稀釋倍數：10。

1.3.3.2 組織樣本

   準確稱取1±0.01 g 均質后的組織樣本（豬肉、雞肉）于50 mL離心管中，加入5 mL 0.01M PBS，充分渦動1 min；4000 g離心10 min；取200 μL上清于新的離心管中，再加入400 μL 0.01M PBS，充分渦動20 s；取50 μL進行檢測。稀釋倍數：18。

2 結果

2.1 SPE標準抑制曲線

圖2 SPE的標準曲線

Fig. 2  The standard curve for SPE by icELISA

對各種工作條件（包括抗原、抗體濃度，酶標二抗濃度、包被方式、抗體稀釋液、加樣體系、反應時間等）進行優化。根據IC₅₀和OD_max確定最佳工作濃度，總原則是選擇使標準曲線IC₅₀值更低、OD_max范圍在1.8~2.2的工作條件。圖2是使用四參數擬合的SPE標準曲線，IC₅₀=1.78 ng/mL，R²=0.9926。

2.2   抗體特異性

本研究所用的SPE多克隆抗體與氨基糖苷類抗生素的交叉反應情況如表1，SPE抗體與其他氨基糖苷類化合物有輕微交叉，說明抗體的特異性強，可以特異的檢測待測樣本中SPE。

表1 SPE與結構類似物化合物的交叉反應率

Table 1  The cross-reactivity of SPE with related compounds

2.3   樣本檢測

2.3.1  確定檢測限（LOD）

分別測定20份牛奶、雞肉、豬肉樣本的空白組織，取其測定平均值（X）加3倍標準差（SD），即LOD =X+3SD，計算SPE在牛奶、雞肉、豬肉的LOD分別為4.8 μg/L、9.3 μg/kg和10.0 μg/kg。

2.3.2  添加實驗

準確度和精密度是評價檢測方法可靠性的重要指標，在ELISA工作中，準確度和精密度分別用回收率和精密度來評價。根據檢測線性范圍及檢測要求，SPE在牛奶中的添加濃度為4.8 μg/L、9.6 μg/L，在雞肉中的添加濃度為9.3 μg/kg、18.6 μg/kg，在豬肉中添加濃度為10 μg/kg、20 μg/kg。每種樣品分別取三個不同批次，每個批次5個樣本，按照本試驗確定的ELISA方法檢測并計算批內和批間的回收率及其變異系數。

表2 SPE在三種樣本的回收率和變異系數

Table 2  The recoveries and coefficient of variation in the three samples of SPE

從表2可以看出，在牛奶、雞肉、豬肉樣品中添加不同濃度的大觀霉素，批內添加回收率在77.1%至116.0%，批內變異系數在4.6%至9.7%，批間添加回收率在82.3%至118.2%，相應的批間變異系數在6.8%至12.3%。無論是批內還是批間，所有樣本的添加回收率均在70%至120%之間，變異系數也都小于15%。結果表明新建立的檢測SPE殘留的ELISA方法在準確性和精密度上達到了獸藥殘留檢測的要求^[6]。

1.3.3 與儀器分析比較

ELISA與GC/MS比較結果見表3。GC/MS條件：色譜柱，毛細管色譜柱Rtx-5，30m×0.25 mm；載氣，氦氣；柱流速：1mL/min；進樣體積：1μL；進樣口溫度：280℃；掃描離子：145，171，187，201。

表3 IcELISA測定結果與GC/MS測定結果的比較

Table 3 The comparison of results determined by indirect competitive ELISA and GC/MS

GC/MS檢測限是50 μg/kg（μg/L），這個濃度的SPE對于ELISA來說，還需要進一步稀釋才能分析。牛奶樣本需要稀釋10倍，組織樣本稀釋5倍后應用于ELISA。由表3可知，經單因素方差分析，兩種方法的分析結果無顯著性差異（P＞0.05），進一步說明，本研究所建立的ELISA方法可用于牛奶及組織樣品中SPE的檢測。

3 討論

本研究工作的目的是建立大觀霉素的ELISA方法并將其應用于樣本檢測中。關于大觀霉素免疫分析方法，國內外報道較少，但都局限于抗體制備及ELISA方法建立，沒有關于應用性的研究報道^[1,5,7]。

研究過程中發現，反應時間的長短對最后的反應結果會有很大的影響。抗原-抗體的結合是一個動態平衡的過程，需要一定的反應時間達到所謂的“平衡”的狀態。時間過則短體系還沒有充分反應，這種情況下中斷反應會使得反應結果太過依賴操作時間，重復性不好；時間過長雖然反應已充分，但過長的反應時間導致外界影響因素增多，使得反應出現不正常的平衡移動，從而干擾反應結果，影響檢測的準確性。在本研究中，反應時間30 min時反應已達到平衡，此時反應靈敏度最高。隨著時間的推移，靈敏度反而變小，因此選擇反應時間為30 min比較合理。

為滿足市場對快檢產品的要求，本研究依靠高靈敏度的抗原、抗體，通過對各個條件進行優化，采用“一步法”（one-step），即標準品、酶標二抗、一抗按照順序先后加入微孔板并進行孵育反應，而不是分成“標準品+一抗”、“酶標二抗”兩步進行，減少了其中的洗板過程，簡化了反應步驟，適應了市場對快檢產品“快”的要求。

參考文獻

[1]  Thacker, J. D., Casale , E. S., Tucker, C, M. Immunoassays (ELISA) for Rapid, Quantitative Analysis in the Food-Processing Industry [J]. J. Agric. Food Chem. 1996, 44, 2680-2685

[2]  Medina A B. Development of a Fluorescent Latex Immunoassay for Detection of a Spectinomycin Antibiotic [J]. J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 3231-3236.

[3]  中華人民共和國農業部。GB 29685-2013 動物性食品中林可霉素、克林霉素和大觀霉素多殘留的測定  氣相色譜-質譜法 [S]。2013-09-16。

[4] 中華人民共和國農業部。農業部235號公告：動物性食品中獸藥殘留最高限量[EB/OL]。http://www.moa.gov.cn/zwllm/tzgg/gg/2002-12-24。

[5]  王照鵬，李向梅，王文珺等。大觀霉素人工抗原的合成及其多克隆抗體制備[J]。中國畜牧獸醫，2014，41（2）：54-57。

[6]  中華人民共和國農業部。農醫發[2005]17號：獸藥殘留酶聯免疫試劑（盒）備案參考評判標準[S]。2005-06-23。

[7]  曹馨勻，張云濤，楊福軍等。大觀霉素酶聯免疫吸附檢測方法的建立[J]。蘭州大學學報（醫學版），2009，35（2）：44-46。

文章來源：《動物醫學進展》，2016,37(1):43-46