雙抗夾心ELISA

實驗概要

夾心  ELISA 法是應用兩種抗體協同測定抗原含量的方法（即：捕獲抗體和檢測抗體）。因此抗原必須包含至少 2 個能被抗體識別的抗原位點。在夾心  ELISA  中，單克隆抗體和多克隆抗體都可以被用作捕獲抗體和檢測抗體。單抗識別單一的抗原表位，可以區別抗原的微小差別，使抗原得到更精確地檢測和定量。多克隆抗體通常被用作捕獲抗體，以捕獲盡可能多的抗原。

夾心 ELISA 的優勢是樣品在分析前不需要純化，檢測靈敏度高（靈敏度是直接法或間接法的 2-5 倍）。

實驗步驟

1.   包被捕獲抗體

1)   用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液 (pH 7.4) 稀釋捕獲抗體至濃度 1-10 μg/ml，包被酶標板。

2)   封口膜覆蓋酶標板，于 4 °C 孵育過夜。

3)   倒掉包被液，用磷 PBS 洗板 2 次，每孔 200 μl。在水池上輕甩倒掉洗液，在紙巾上輕拍酶標板除去殘留液體。

2.   封閉和加樣品

1)   封閉包被后孔內殘留的蛋白結合位點,每孔加 200 μl 含 5% 脫脂奶粉的 PBS 的封閉液。

2)   封口膜覆蓋酶標板，室溫孵育至少 1-2 小時，或者方便的話 4 °C 孵育過夜。

3)   每孔加 100 μl 適當稀釋的樣品。在精確定量測定時，通常將未知濃度樣品與標準曲線相比較，每塊板都要做標準（做兩份或者三份）和空白對照以保證精確性。37 °C 孵育 90 分鐘。

4)   倒掉樣品，PBS 洗板 2 次，每孔用 200 μl。

3.   用檢測抗體和二抗先后進行孵育

1)   每孔加入 100 μl 稀釋好的檢測抗體。

2)   封口膜覆蓋酶標板，室溫孵育 2 小時。

3)   PBS 洗板 4 次。

4)   加入標記二抗，每孔 100 μl，使用前用封閉液快速稀釋至最佳濃度（參照使用手冊）。

5)   封口膜覆蓋酶標板,室溫孵育 1-2 小時。

6)   PBS 洗板 4 次。

4.   檢測

使用多通道移液器加入底物溶液，每孔 100 μl（或 50 μl）。