發際線后移？探究毛囊干細胞起源！

　　現代社會中，隨著工作生活壓力增大，許多人發現自己頭發變得越來越稀疏，發際線不斷后移。調查顯示，有數億男性，女性甚至兒童都有脫發的經歷，脫發已經成為困擾當代年輕人的一個嚴重問題。

　　毛囊其實是一個微型器官，其主要功能就是生發。毛囊干細胞的不對稱分裂模式，即經過分裂和分化形成毛發和另一個毛囊干細胞，保證補充掉落頭發的同時也保證了延續性。而基板（placode）是包括毛囊在內的大多數外胚層附屬物形成的基礎。毛發基板向皮膚延伸，并發展成具有縱向排列間隔的圓柱形結構。

　　然而，關于未成熟基板細胞如何發展成為成熟毛囊結構，以及干細胞如何在細胞和轉錄水平上調控尚不清楚。并且研究上皮細胞譜系發育起源的最主要的障礙是缺乏特異性標記物，無法對每一個細胞譜系進行前瞻性識別和追蹤。

　　2021 年 6 月 9 日，日本 RIKEN 生物系統動力學研究中心 Hironobu Fujiwara 團隊在 Nature 上發表題為 Tracing the origin of hair follicle stem cells 的研究論文。

　　圖片來源：Nature

　　研究內容

　　干細胞來源于基板外環

　　為了在不依賴分子標記的情況下，研究毛囊干細胞的發育起源和譜系動態，研究人員開發了胡須毛囊的體外長期培養和成像系統。利用上皮細胞中表達 H2B eGFP 的轉基因小鼠的胚胎胡須外植體，研究人員從 hair germ stage 到 hulbou peg stage 進行連續成像并追蹤上皮細胞，根據重構的 3D 細胞軌跡在 hair germ stage 對其進行顏色編碼。

　　研究發現，培養 60 小時后，大部分 hair germ stage 上層的基底細胞產生了 bulbous peg stage 的上層基底細胞，而下層部分則由下層形成。鄰近皮膚乳頭的細胞保留在上皮細胞和皮膚乳頭之間，或脫離基底膜分化。

　　這些結果表明，毛囊形態發生是每一個縱向排列的上皮細胞間隔的擴大，而不是主要的毛發生殖細胞的繼續增加。

　　圖片來源：Nature

　　為了探究毛囊上皮細胞起源和早期世系動力學，研究人員利用小鼠模型獲得了 hair placode stage 的實時圖像數據。隨后進行回顧性細胞追蹤，發現位于皮膚乳頭附近的上皮細胞最初位于基板基底層的中心。下層區域的細胞來源于基板的中心區域外，上部的細胞（putative prospective bulge stem cells）來源于基板底層的外周環。

　　這些結果表明，3D 胡須毛囊上皮細胞中縱向排列的圓柱形間隔與基板基底部 2D 同心環是匹配的，putative prospective bulge stem cells 來源于基板周圍的上皮基底細胞。

　　圖片來源：Nature

　　位置決定基板細胞命運

　　為了評估胡須毛囊早期發育中細胞分裂方向與后期細胞命運的關系，研究人員在實時成像數據中測量了上皮基底層基底膜區域的 3D 細胞分裂方向。在每個組織區域將細胞分為水平和垂直分裂組，追蹤它們子細胞到 hair germ stage。發現無論細胞分裂角度如何，來自基板上下層和毛胚區的子細胞分別參與了 hair germ stage 細胞的形成。

　　這些結果表明上皮細胞在胡須基板的命運取決于細胞在基板內的位置，而與細胞分裂方向無關。

　　圖片來源：Nature

　　基板同心轉錄區

　　為了進一步探究上皮細胞如何逐步改變其細胞狀態，從而產生包括 prospective bulge stem cells 在內的多種上皮細胞，研究人員開發了表達 photo-convertible fluorescent protein 的 ROSA26 報告細胞系，對目標毛囊進行光標記。通過對來自不同時期胡須胚胎毛囊進行光轉換，隨后進行 single-cell RNA-sequencing（ScRNA-seq）。研究人員鑒定出 962 個上皮亞群的單細胞轉錄組，分析發現在整個發育過程中，沿著毛囊的縱軸有不同的區段表達模式。

　　這些結果表明 ScRNA-seq 庫包括胡須毛囊發育過程中多種類型上皮細胞，具有準確的階段和定位信息，從而使這些庫適合描述毛囊形態發生過程中細胞狀態轉變的時空動態。

　　為了檢測 2D 同心譜系區域是否已經獲得不同的細胞狀態，研究人員首先用 E12.0 衍生的轉錄組重建了 pseudospace 軌跡，使用 pseudospace ScRNA-seq 數據來識別有明顯改變的 4342 個基因，排序成 20 個集合。研究發現許多基因在基板中心或 interfollicular epidermis（IFE）區域達到峰值，而包括干細胞標記物在內的大量基因在這些區域之間出現峰值，表明基因表達從基板中心到 IFE 逐漸變化的同心區的存在，即基板周圍有環狀基因表達。

　　圖片來源：Nature

　　組織轉錄協調

　　為了分析不同上皮細胞群體在毛囊發育中多樣化，研究人員從轉錄組中移除了最終分化的細胞，利用擴散圖重建了基底上皮細胞的發育軌跡。擴散圖顯示 hair germ lineage 首先在 E12.0 開始分枝，而其他譜系從 E13.5 開始分枝。

　　為了表征毛囊發育過程中的轉錄動態，研究人員檢測了每個譜系進程中的上調和下調基因。結果鑒定了 13 個基因簇，建立了毛囊發育過程中整個上皮細胞基因表達的整體動態。其中 4 個基因簇在 5 個細胞系中表現出相似的基因表達變化。因此，單細胞轉錄分析確定了與細胞譜系多樣化相關的 13 個轉錄基因簇。

　　圖片來源：Nature

　　研究結論

　　本研究結合了不依賴標記的長期 3D 活體成像和單細胞轉錄組學，以捕獲小鼠毛囊發育過程中整個上皮細胞的動態譜系進展和轉錄組變化。

　　本文建立了毛囊發育的動態圖譜和用于外胚層器官發育的廣義模型，即基板 2D 同心區域外形成了 3D 縱向排列的圓柱形空間。并且表明基板細胞的命運取決于細胞的位置，而不是細胞分裂的方向。

　　本研究為進一步研究皮膚器官發生與信號和細胞區隔化的耦合機制，從而為干細胞及其生態位的出現提供了基礎。