基于徠卡THUNDER高對比度成像技術的轉基因斑馬魚胚胎篩選應用流程

　　摘要

　　本應用報告介紹了如何利用徠卡顯微系統的DM6 B顯微鏡平臺及其集成的THUNDER高對比度成像技術，建立一套高效率、高對比度、適用于低表達蛋白檢測的斑馬魚胚胎篩選流程。該技術基于徠卡的光學成像系統，可顯著降低厚樣本的焦外模糊，提升圖像對比度。THUNDER與徠卡的SynapseTM高速觸發系統、8通道LED照明和K8 sCMOS相機協同工作，形成一套便于抽取信息、適用于動物模型篩查的標準化成像方法。

　　1.品牌與技術背景

　　1.1 徠卡顯微系統簡介

　　徠卡顯微系統是一家專注于光學顯微成像、數字成像解決方案和樣本分析技術的專業制造商。其核心技術體系包括集成于成像平臺中的THUNDER高對比度成像技術、LIGHTNING反卷積、高端物鏡平臺以及sCMOS相機。

　　1.2 THUNDER技術定位

　　徠卡THUNDER是一種集成于其光學顯微鏡平臺的高對比度成像技術，專為厚組織與3D培養物設計。該技術通過實時處理，能有效去除由厚樣本散射引起的焦外模糊，從而顯著提升圖像的熒光對比度，特別適合斑馬魚胚胎這類厚度較大、散射顯著、熒光表達差異大的樣本。

　　2.應用背景：斑馬魚胚胎篩選的挑戰

　　2.1 行業需求

　　轉基因斑馬魚胚胎廣泛應用于發育生物學與體積成像實驗（如光片顯微鏡）。篩選是否具有足夠蛋白表達，是進入下游三維成像前的關鍵步驟。

　　2.2 傳統技術的局限性

　　體視顯微鏡：分辨率和靈敏度不足，低表達樣本容易被漏判。

　　傳統寬場顯微鏡：厚樣本下焦外模糊嚴重，導致對比度下降。

　　因此需要一種高對比度+低光劑量+高速切換+可靠檢測低表達信號的成像系統，而這正是徠卡THUNDER的優勢所在。

　　3.徠卡 DM6 B + THUNDER的篩選方法與工作流程

　　3.1 使用設備

　　● 徠卡DM6 B寬場顯微鏡

　　● 集成THUNDER高對比度成像功能的圖像處理模塊

　　● 徠卡K8 sCMOS相機

　　● 徠卡SynapseTM高速觸發系統

　　● 徠卡pE800 8通道熒光光源

　　● 徠卡HC APO/HC FLUOTAR系列高數值孔徑物鏡

　　3.2 操作流程

　　步驟1：樣本安裝

　　將斑馬魚胚胎置于35mm培養皿，適配THUNDER Imager Tissue平臺。

　　步驟2：低倍概覽

　　使用徠卡1.25x/0.04干式物鏡進行明場概覽觀察。

　　步驟3：LAS X Navigator導航

　　使用徠卡LAS X Navigator軟件標注需要進一步篩查的ROI。

　　步驟4：高倍確認

　　切換到高分辨率物鏡，配合低光照、短曝光與高速觸發，確保內源熒光不受光漂白影響。

　　步驟5：啟用THUNDER高對比度成像模式

　　在徠卡LAS X軟件中開啟THUNDER成像模式：

　　● 基于徠卡光學系統獲取的圖像數據，實時去除焦外模糊

　　● 增強低表達蛋白的信號可見度

　　● 在預覽階段即可獲得清晰圖像，用于快速判斷

　　4.篩選結果與表現

　　4.1 對比度提升顯著

　　徠卡THUNDER高對比度成像技術能顯著降低由厚樣本引入的焦外模糊，使熒光結構邊界更清晰，背景噪訊得到有效抑制。

　　4.2 低表達信號也可穩定檢測

　　徠卡K8 sCMOS的高靈敏度與THUNDER成像技術的背景抑制能力相結合，可在低光照條件下獲得高信噪比的圖像，非常適合低表達蛋白篩查。

　　4.3 全流程高效銜接

　　“徠卡DM6 B顯微鏡平臺 → Leica LAS X Navigator軟件 → 集成的THUNDER成像功能”形成連續、快速、可視化強的篩查鏈路。

　　5. 應用場景案例

　　以下流程均由徠卡顯微系統成像平臺實施：

　　● 使用具備THUNDER成像功能的徠卡THUNDER Imager Tissue系統進行低倍概覽與熒光篩查

　　● 以徠卡K8 sCMOS相機在555 nm、2% LED強度、150 ms曝光條件下成像，并通過THUNDER模式實時增強mKate信號對比度

　　● 研究團隊成功在低表達條件下識別目標胚胎，減少無效樣本進入下游光片體系

　　6. 結論：徠卡在斑馬魚篩選中的價值

　　徠卡DM6 B顯微鏡與其集成的THUNDER高對比度成像技術為斑馬魚胚胎篩選提供：

　　● 高對比度、可復現的熒光成像

　　● 對低表達蛋白的穩定檢測能力

　　● 高速操作流程

　　● 低光損、適用于后續活體成像工作流

　　● 適配多種徠卡物鏡的靈活擴展性

　　此方法可顯著提升實驗流效率，并為光片顯微鏡等3D培養物成像方式提供高質量樣本篩選。