巨噬細胞吞噬功能的檢測

實驗概要

巨噬細胞承擔著吞噬、消除細胞內寄生菌、真菌，和清除衰老的自身細胞的職能，它在特異性體液免疫或細胞免疫應答中都有重要作用，所以巨噬細胞的吞噬消化功能，在一定程度上可以反映機體的免疫狀態。本實驗用體內法和體外法兩種方法測定了巨噬細胞的吞噬功能。

實驗步驟

1. 體內法

   1) 材料

      a．小鼠健康昆明系小鼠，體重20~25g。

      b．生長液0.5%水解乳白蛋白液(用Hanks液配制，水浴加熱溶解)，加10%滅活的小牛血清，用7%NaHCO₃調整pH值為7.6。

      c．細菌懸液將4mg/ml卡介苗(BCG)做8倍稀釋(即1份BCG加7份生理鹽水)，也可用培養36h的鏈球菌液體培養物。

   2) 方法

      a．誘導產生大單核細胞具體作法是，①用乙醚將小鼠麻醉(勿致死)，固定四肢，75%酒精消毒腹部，用眼科鑷子提起腹部皮膚，沿腹中線剪開皮膚，不得傷及腹膜，然后將皮膚向兩側分開，并固定；②用6號針頭往腹腔內注射生長液30ml，輕輕按壓腹部，使大單核細胞游離出來。

      b．注射卡介苗在注射生長液后大約5~10min，再往腹腔內注入稀釋的卡介苗(BCG) 1ml，或鏈球菌培養物1ml，并不斷地輕輕按壓小鼠腹部，約5min后，用9號針頭抽取腹腔液，滴加在已消毒的載玻片上(用前以火焰滅菌)，然后放在濕盒內，于37℃孵育30min后，大單核細胞即粘附在玻片上，用生理鹽水或Hank′s液漂洗1~2次。

      c．染色及鏡檢抗酸性染色。如注射的不是卡介苗，可采用普通染色法。染色畢，用油鏡檢查。

   3) 結果油鏡下檢驗時，可見大單核細胞的胞漿中有許多被吞噬的結核桿菌(BCG)或鏈球菌。

2. 體外法(皮泡法)

   1)材料

      a. 10%斑蝥乙醇浸出液：取斑蝥10g，加乙醇100ml，于室溫下浸出數日后使用。

      b. 雞紅細胞懸液：從雞翼下靜脈或心臟采血，按1∶5比例保存在阿氏液中，放4℃冰箱可供2周使用。臨用時取所需量，加生理鹽水，1 500r/min離心5min，洗3次，第3次2 000r/min離心5min，棄上清液，取壓積紅細胞用生理鹽水配制成5%懸液。

   2)方法

      a. 皮泡形成：具體方法是：①在動物皮膚被毛稀少的部位，如股內側、腹部等，剪毛，用剃刀刮凈；②用小鑷子取1cm²大小濾紙片，蘸上斑蝥乙醇浸出液，貼在剃毛的部位，在濾紙上壓一小玻片，上面再敷以清潔紗布，用膠布或繃帶固定好；③4~5h后，斑蝥作用部位的皮膚層開始移動，此時可將紗布、玻片、濾紙一并取下，換一個拱形塑料蓋，用紗布或膠布固定，以防止水泡破裂；④48h后，在敷斑蝥處的皮膚上形成一個同蓋片一樣大小的水泡，用無菌注射器小心將皮泡液全部吸出，局部以無菌紗布覆蓋，2h后可取下紗布。

      b. 吞噬試驗：皮泡液1ml加5%雞紅細胞懸液0.04ml，放小試管內，再將兩片小蓋玻片(用普通蓋玻片分切而成)重疊斜放在試管底部，37℃水浴30min，每10min振搖一次。溫育結束后，將小蓋玻片從試管中取出(在試管液體內輕輕振蕩幾次，使游離的雞紅細胞和不貼壁的吞噬細胞從玻片上脫落)，放在載玻片上，吹干后，用瑞氏姬姆薩氏液染色。

亦可將皮泡液1ml 1500r/min離心5min，去上清液，留液體約0.05ml，再加入5%雞紅細胞懸液0.04ml，混勻后，放37℃水浴30min，中間振蕩一次。溫育后推片，吹干，染色，鏡檢。

   3) 結果在油鏡下觀察巨噬細胞吞噬雞紅細胞的情況，數200個巨噬細胞，可用下述兩個指標表示吞噬活性：

      a．吞噬百分比即每100個巨噬細胞中吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數。

      b．吞噬指數將100個巨噬細胞吞噬的雞紅細胞的總數除以100，得吞噬指數，即每個巨噬細胞吞噬雞紅細胞的平均數。

另外，計數時，可同時記錄雞紅細胞被消化的程度，以供參考。消化程度一般分以下四級：

      Ⅰ級：未消化，胞質淺紅或淺黃帶綠色，胞核呈現淺紫紅色。

      Ⅱ級：輕度消化，胞質淺黃綠色，核凝縮，呈紫藍色。

      Ⅲ級：重度消化，胞質淡染，胞核呈現淺灰黃色。

   Ⅳ級：完全消化，只見形狀類似雞紅細胞大小的空泡，邊緣整齊，胞核模糊可見。

注意事項

在吞噬試驗中，于皮泡液內加少量肝素可防止因纖維蛋白析出而造成的試驗失敗。本法操作簡便，無需復雜的儀器設備，便于推廣。