干細胞穩定轉染操作步驟

外源基因進入細胞主要有三種方法：電擊法、磷酸鈣法和脂質體介導法，實際上其基本原理都是利用不同的方法在細胞上短時間暫時性的穿孔讓外源質粒進入，但是由于前兩者的效率低且傷害較大，所以現在除了對于一些特殊細胞系，一般的轉染方法都利用脂質體。

利用脂質體轉染和其他方法一樣，最重要的就是防治其毒性，因此脂質體與治理的比例，細胞密度以及轉染的時間長短和培養基中血清的含量都是影響轉染效率的重要問題，通過實驗摸索的合適轉染條件對于效率的提高有巨大的作用。

本實驗學習和掌握外源基因導入真核細胞的主要方法 — 脂質體介導的轉染。了解外源基因進入的一般性方法，觀測外源蛋白的表達（綠色熒光蛋白）。

【試劑與儀器】

1 、胎牛血清。

2 、雙抗溶液（鏈霉素 100μg+ 青霉素 100 單位）。

3 、DMEM 培養基。

4 、轉染試劑（ LIPOFECTAMINE 2000 ）。

5 、細胞培養基（ DMEM+10%NCS ）。

6 、PBS 。

7、無血清培養基。

8 ．胰酶（ Trypsin ）。

9 ．培養皿，移液管，量筒，恒溫水浴箱，離心機， 15ml 離心管，微量移液器，熒光顯微鏡和 CCD 。

【操作步驟】

（1）轉染條件的優化

為了得到最高的轉染效率和最低的非特異性的效果，優化條件是必要的，其中包括細胞的密度以及DNA和脂質體的含量。要確保細胞的匯合率大于90％，調整DNA和脂質體的比值從1:0.5 到1:5來進行優化。

（2）正式轉染步驟

1 、轉染前一天，胰酶消化細胞并計數，細胞鋪板，使其在轉染日密度為 90% 。細胞鋪板在 0.5ml 含血清，不含抗生素的正常生長的培養基中。

2、對于每孔細胞，使用 50μl 無血清 DMEM 培養基稀釋 0.8μg-1.0μg DNA 。多孔操作可以批量制備。

3、對于每孔細胞，使用 50μl DMEM 培養基稀釋 1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000 試劑。 LIPOFECTAMINE 2000 稀釋后，在 5 分鐘內同稀釋的 DNA 混合。保溫時間過長會降低活性。

4、混合稀釋的 DNA （由第 2 步）和稀釋的 LIPOFECTAMINE 2000 （由第 3 步）。在室溫保溫 20 分鐘。復合物可以在室溫保持 6 小時穩定。注意：溶液可能會混濁，但不會影響轉染。

5、直接將復合物加入到每孔中，邊加邊搖動培養板，輕輕混勻。注意：如果在無血清條件下轉染，使用含血清的正常生長培養基進行細胞鋪板。在加入復合物前移去生長培養基，替換為 0.5ml 無血清培養基。

6、在 37℃ ， 5 ％的 CO 2 中孵育 24-48 小時，無須去掉復合物或更換培養基或者在 4-5 小時后更換生長培養基也不會降低轉染活性。

7、在細胞中加入復合物 24-72 小時后，分析細胞抽提物或進行原位細胞染色，檢測報告基因活性。這依賴于細胞類型和啟動子活性。

對穩定表達，在開始轉染一天后將細胞傳代至新鮮培養基中，兩天后加入篩選抗生素。進行穩定表達需要數天或數周。