我科學家用CRISPR糾正癲癇致病突變

　　編碼Nav1.1通道α亞基的SCN1A基因發生突變，可導致具有各種臨床表型的癲癇，這與通道功能缺失或功能獲得的對比效果有關。近期，來自中國科技大學、中科院廣州生物醫藥與健康研究院、廣州醫科大學第二附屬醫院和中南大學的研究人員，在Nature子刊《Translational Psychiatry》發表題為“CRISPR/Cas9 facilitates investigation of neural circuit disease using human iPSCs: mechanism of epilepsy caused by an SCN1A loss-of-function mutation”的學術成果。在這項研究中，研究人員將近年來迅猛發展的基因組編輯技術與iPSC來源的模型結合起來，糾正了癲癇患者iPSC中的致病突變。

　　本文通訊作者是中科院廣州生物醫藥與健康研究院的李志遠研究員，其1997年博士畢業于中南大學并赴日本留學，2000年獲日本德島大學博士學位。2000年至2007年先后在美國范德堡大學和圣路易斯大學從事博士后研究工作和助理教授。研究領域主要包括細胞膜離子通道蛋白的研究、P2X受體的結構與功能研究和干細胞的神經分化與電生理研究，研究成果多次發表在Neurosci Lett、Scientific Reports、Stem Cell Research、Journal of neuroscience research等國際學術期刊。

　　SCN1A基因突變，可以導致具有廣泛臨床表型的癲癇，從相對良性的癲癇到更嚴重的Dravet綜合征。有些癲癇如Dravet綜合征，產生了治療耐藥性，其余類型癲癇的治療，主要依賴于抗癲癇藥物。目前市場上有超過20種抗癲癇藥物可供使用，它們有不同的作用機制和靶標。關于SCN1A所致的癲癇的機制，我們所了解的信息還很有限，這對于醫生選擇藥物協同控制癲癇發作、同時最大限度地減少不良影響，一直都是具有挑戰性的。延伸閱讀：用人類干細胞衍生的神經元治療癲癇。

　　在轉染系統中異源檢測到的癲癇SCN1A突變體，顯示出不同的電生理學改變，主要可以分為功能缺失突變和功能獲得突變。功能缺失突變更為常見，并與癲癇更嚴重的臨床表現有關。目前存在很多種癲癇的動物模型和患者誘導多能干細胞（iPSC）衍生模型。然而，這些研究對于SCN1A基因有關的任何癲癇的機制，都沒有得到深刻的見解。

　　這些動物模型主要使用Nav1.1缺失來模仿功能缺失突變。在小鼠大腦中敲除Nav1.1，可導致小腦和海馬體中GABA能神經元中的Nav流和興奮性降低，但興奮性海馬錐體神經元中沒有檢測到變化。然后，研究人員發現，選擇性刪除GABA能神經元中的Nav1.1，足以引起小鼠癲癇，并且，在興奮性神經元中額外刪除Nav1.1，可緩解現有的癲癇癥狀。

　　Nav1.1刪除的動物模型所產生的這些結果表明，GABA能神經元的功能障礙，可能參與了這種疾病的發生。然而，來自患者iPSC衍生模型的研究結果表明，在假定的抑制性和興奮性神經元中的鈉離子增加，與增加的誘發動作電位（AP）和自發放電有關。理解這些看似矛盾的結果是很困難的；特別是當iPSC衍生模型具有一些固有的局限性。iPSCs提供的系統其中一個最嚴重的問題是，它不能平衡興奮性和抑制性神經亞型的矛盾，該模型應該特別關注表達Nav1.1的神經元亞型，以確定突變的直接影響，并確定疾病的起源。

　　癲癇發作，是由于神經抑制與興奮之間的失衡，包括兩種神經亞型以及它們通過突觸連接的相互作用。在大腦中，Nav1.1主要在GABA能神經元以及一小部分興奮性椎體神經元中表達。Nav1.1的這個偏置分布表明，該疾病起源于某一亞型，在疾病過程中有兩個亞型以不同的方式參與。顯然，現有的iPSC衍生模型不能提供一個包含這兩種神經元的系統，同時在電生理學研究中可允許區分不同的亞型，并集中在表達Nav1.1的亞型。此外，iPSC衍生模型是基于不同遺傳背景之間的比較，但是據報道，遺傳背景能夠調節癲癇病的嚴重程度，這可能會進一步影響到我們對“所觀察到的疾病相關差異”的認識。

　　在這項研究中，研究人員將CRISPR/Cas9和TALEN介導的基因編輯技術，應用于iPSC為基礎的疾病模型，來探討SCN1A功能性缺失突變所致的癲癇發病機制。通過利用CRISPR/Cas9對iPSC衍生的神經元中的GABA能神經元亞型進行熒光標記，研究人員首次對表達SCN1A的神經亞型進行了電生理學研究，并監測了抑制性和興奮性類型的突觸后活動。

　　研究人員發現，突變c.a5768G，可導致外源性轉染系統中沒有Nav1.1流，不僅影響Nav電流量的性質，而且也影響表達Nav1.1的GABA能神經元的Nav激活。Nav的兩個變化，進一步減少了幅度，并增強了患者來源的GABA能神經元的動作電位閾值，導致患者來源的神經元網絡中的自發性抑制性突觸后電流（sIPSCs）減弱。

　　雖然自發的興奮性突觸后電流（sEPSCs）變化不明顯，但是，當進一步分析sIPSCs和sEPSCs的頻率之后，研究人員發現，整個突觸后活動從抑制為主的狀態轉化為患者來源的神經元網絡的激發態，這表明，僅僅sIPSCs的變化就足以顯著逆轉自發性突觸后活動的興奮性水平。

　　總之，這些研究結果填補了我們對于“SCN1A突變對轉染外源性細胞的影響和對表達nav1.1的神經元的影響之間的關系”的認識上的空白，并揭示了SCN1A功能缺失突變所致的癲癇發生的根本生理學機制。