實驗概要
本實驗利用間歇循環刺激法制備了抗原特異性T細胞克隆。
實驗原理
間歇循環刺激法是制備抗原特異性T細胞克隆的傳統方法，原理是經抗原間隔刺激多個循環。
主要試劑
1. 含10％人AB型血清的完全RPMI 1640培養液。
主要設備
1. 24孔培養板；
2. CO2 溫箱；
3. 高速離心機；
4. 96孔板；
5. 超凈工作臺；
6. 顯微鏡。
實驗材料
1. 抗原致敏供者的單個核細胞(MNC)和經過3300rad照射的自身MNC；
2. 抗原。
實驗步驟
1. 抗原刺激：于24孔培養板加入單個核細胞5×106 /2ml/孔和最適濃度的抗原，置37℃，5％CO2 溫箱培養7d。
2. 間歇循環刺激：
1) 重懸經過抗原刺激的細胞，并經密度梯度離心，收集界面層細胞，用無血清的RPMI-1640洗二次；
2) 調整細胞濃度至1×106 /ml，加入24孔培養板孔中，同時各孔加入經過照射的自身MNC 4×106 ，以未照射的自身細胞作為飼養細胞和抗原提呈細胞，培養7d；
3) 同步驟1)收集和洗滌細胞；
4) 調整細胞濃度至1×106 /ml，與2～3×106 新鮮照射的自身MNC及抗原共同培養7d；
5) 重復步驟2)～4)共3個循環；
6) 收集細胞，通過增殖試驗測定抗原的特異性。
3. T細胞克隆：間歇循環刺激培養的細胞經有限稀釋，于96孔板依次加入不同濃度的細胞懸液，同時克隆板孔中加入104 經過照射的自身MNC、IL-2 30U和適當濃度的抗原，同上述條件培養7～10d，顯微鏡下觀察細胞生長情況。將生長良好的抗原特異性細胞轉至24孔板孔中，加入自身飼養細胞和抗原，繼續培養7d，傳代并經間歇刺激培養。
注意事項
1. 上述方法制備的T細胞克隆未區分出CD4 和CD8 T細胞，二者均可能被克隆；
2. 在有限稀釋之前，IL-2的量不宜過高，否則可能發生T細胞非特異性增殖。
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