數字PCR應用（一）

一． PCR的發展歷史

PCR技術自問世以來，在遺傳病、病原體、癌基因等分子診斷領域和法醫鑒定等方面發揮了巨大作用。第一代 PCR在進行擴增后通過凝膠電泳進行定性分析。

隨著生物分子熒光技術的發展，1992年實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR) 應運而生。qPCR是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質熒光強度來測定每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環后產物總量的方法。由于在PCR擴增的指數時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數存在線性關系，所以Ct值也就成為定量的依據。基于熒光探針或染料的第二代 PCR 技術隨后逐漸發展為檢測核酸目標片段的主流分子診斷學技術。

在實時定量 PCR（qPCR） 過程中，熒光信號隨著擴增產物的積累而增強。qPCR 能夠實時獲得模板擴增的熒光值，然后根據DNA 模板在指數增長時期的 Ct 值與標準 DNA 的Ct值比較來計算初始模板的濃度。但是這種方法由于是大體積反應系統，非特異性的擴增增加了假陽性結果和背景信號，因此，最終無法獲得絕對定量的結果。

隨著MEMS工藝的不斷成熟和微流控技術的不斷發展，新一代PCR技術，數字PCR(digital PCR, dPCR) 也隨之出現。digital PCR是一種新的絕對定量PCR，主要是對PCR反應物進行有限稀釋，隨后在不同的反應腔室里進行PCR擴增，最后根據泊松分布原理及陽性微滴的個數與比例得出靶分子的起始拷貝數或濃度的技術。

圖1. PCR技術的發展歷程

二． 數字微流控（dPCR）的原理

20 世紀末，Vogelstein 等提出數字PCR( digitalPCR，dPCR) 的概念，通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應單元，每個單元包含一個或多個拷貝的目標分子( DNA 模板) ，在每個反應單元中分別對目標分子進行PCR 擴增，擴增結束后對各個反應單元的熒光信號進行統計學分析。

dPCR是一種核酸分子絕對定量技術。

dPCR一般包括兩部分內容，即PCR擴增和熒光定量分析。

在PCR 擴增階段，與傳統技術不同，dPCR一般需要將樣品稀釋到單分子水平，并平均分配到幾萬個反應腔室里反應。這樣子相當于變相的對靶基因進行富集。與此同時，由于對原樣品的大幅度的稀釋，使得PCR抑制劑濃度顯著降低，這樣dPCR對初始PCR反應物里抑制劑的要求顯著低于qPCR。

不同于 qPCR對每個循環進行實時熒光測定的方法，dPCR 技術是在擴增結束后對每個反應單元的熒光信號進行采集，最后根據泊松分布原理及陽性微滴的個數與比例得出靶分子的起始拷貝數或濃度。

圖2. dPCR基本原理

三. dPCR與qPCR的對比

相對于熒光定量PCR（qPCR）而言，dPCR具備以下優勢：

1、 靈敏度可達單個核酸分子：檢測限低至0.001%，原因在于dPCR可以實現靶標DNA/RNA的富集；

圖3. dPCR可以實現痕量核酸的高靈敏檢測

2、 無需標準品（標準曲線），即可對靶分子起始量進行絕對定量；

3、 特別適合基質復雜樣品的檢測：終點PCR檢測，不依賴Ct值，不依賴擴增效率，能克服PCR抑制劑的影響，適合動血樣、FFPE組織、糞便、尿液、痰液、水樣、土壤、植物等復雜樣品中DNA的絕對定量；