數字PCR技術的發展和原理

數字PCR即Digital PCR（dPCR)，它是一種核酸分子絕對定量技術。相較于qPCR，數字PCR可讓你能夠直接數出DNA分子的個數，是對起始樣品的絕對定量。

在定量PCR時，我們常常糾結一個問題，究竟是相對定量還是絕對定量呢？如今，你無需糾結了，因為數字PCR（digital PCR）來了。盡管這兩種技術有些類似，都是估計起始樣品中的核酸量，但它們有一個重要的區別。定量PCR是依靠標準曲線或參照基因來測定核酸量，而數字PCR則讓你能夠直接數出DNA分子的個數，是對起始樣品的絕對定量。因此特別適用于依靠Ct值不能很好分辨的應用領域：拷貝數變異、突變檢測、基因相對表達研究（如等位基因不平衡表達）、二代測序結果驗證、miRNA表達分析、單細胞基因表達分析等。

技術發展：

20世紀末，Vogelstein 等提出數字PCR( digitalPCR，dPCR) 的概念，通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應單元，每個單元至多包含一個拷貝的目標分子( DNA 模板) ，在每個反應單元中分別對目標分子進行PCR 擴增，擴增結束后對各個反應單元的熒光信號進行統計學分析。

數字PCR技術不斷發展，Bio-Rad、LIFE Technologies及RainDance等廠家相繼推出技術較為成熟的數字PCR產品。

QuantaLife公司開發出的微滴數字PCR技術。該產品還獲得了2011年度Frost & Sullivan北美新產品創新獎。2011年10月，Bio-Rad公司收購了QuantaLife和ddPCR技術，相繼推出了QX100、QX200微滴式數字PCR系統。

與其他數字PCR技術不同，Bio-Rad對樣品進行微滴化處理。據該公司基因表達部門的銷售經理Richard Kurtz介紹，他們的獨特優勢是能夠產生非常均一、重復的1納升液滴。這樣的好處是每個樣品形成20,000個液滴，而其他系統只能分成760-3,000個部分。分得越多，則意味著分析越準確。

數字PCR是一種核酸分子絕對定量技術。當前核酸分子的定量有三種方法，光度法基于核酸分子的吸光度來定量；實時熒光定量PCR（Real Time PCR）基于Ct值，Ct值就是指可以檢測到熒光值對應的循環數；數字PCR是最新的定量技術，基于單分子PCR方法來進行計數的核酸定量，是一種絕對定量的方法。主要采用當前分析化學熱門研究領域的微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應器或微滴中，每個反應器的核酸模板數少于或者等于1個。這樣經過PCR循環之后，有一個核酸分子模板的反應器就會給出熒光信號，沒有模板的反應器就沒有熒光信號。根據相對比例和反應器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。

原理：

PCR實際上是一個在模板DNA、引物(模板片段兩端的已知序列)和四種脫氧核苷酸等存在的情況下，DNA聚合酶依賴的酶促合成反應，擴增的特異性取決于引物與模板DNA的特異結合。

數字PCR(Digital PCR)儀器

QX200 Droplet數字PCR(Digital PCR) 系統的應用領域：

癌癥生物標志物研究和拷貝數變異分析
以卓越的靈敏度和準確度測量癌癥突變的變異程度、檢測稀有的 DNA 靶拷貝以及解析拷貝數變異狀態。
病原體檢測
精確地對靶 DNA 或 RNA 分子中的細微變化進行定量分析，從而檢測和監測病原體。
與新一代測序 無縫對接
無需使用標準曲線，直接對 NGS 庫執行絕對定量分析。
基因表達分析
可對少量 mRNA 和 miRNA 的細微變化進行準確及重復性極佳的檢測。
環境監測
使用 QX200 系統可測試多種環境樣品，例如土壤和水。
食品檢測
采用經過驗證的 ddPCR 方法對轉基因生物體 (GMO) 進行評估。