新城疫抗體檢測試劑盒操作方法和技術注意事項

新城疫抗體檢測試劑盒（阻斷法）操作方法和技術注意事項

【產品名稱】

通用名：新城疫病毒抗體檢測試劑盒（酶聯免疫法）

英文名：Test Kit for Antibodies to Newcastle Disease Virus （ELISA）

【預期用途】 新城疫又名偽雞瘟或亞洲雞瘟，是由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）引起的禽類的一種急性高度接觸性傳染病，以呼吸困難、下痢、神經機能紊亂、粘膜出血為特征。

本試劑用于檢測雞、鴨、鵝等禽類血清、血漿或蛋黃中新城疫病毒抗體，可用于免疫效果評價、輔助診斷等。

【原    理】

本試劑盒系由預包被新城疫病毒抗原的酶標板、抗體工作液、酶標記物及其他配套試劑組成，應用競爭酶聯免疫法原理檢測禽類血清、血漿或蛋黃中新城疫病毒抗體。實驗時在酶標板中加入稀釋的待檢樣本和抗體工作液，若樣品中含有新城疫病毒抗體則將阻斷抗體工作液與酶標板上抗原結合，從而使后續反應不出現顯色；反之則出現顯色；顯色深淺與樣品中的特異性抗體含量成負相關；加入終止液終止反應后，產物變為黃色；用酶標儀在450nm波長測定各反應孔中的吸光值，即可知樣品是否含有新城疫病毒抗體。

【試劑盒組成】

【儲存及有效期】 于2～8℃避光保存，有效期為12個月。

包被板開封后請于2～8℃避光保存，避免受潮。使用期限為2個月。

【適用儀器】 含450nm、630nm波長的酶標儀，37℃恒溫設備，可調微量移液器。

【樣品準備】

1. 濃縮洗滌液使用前應恢復至室溫使沉淀溶解，然后用蒸餾水或去離子水20倍稀釋成工作洗滌液。

2. 血清/血漿：取動物全血按常規方法制備血清或血漿，要求血清/血漿清亮，無溶血、無污染。樣品1周內可于2～8℃保存，長期需置-20℃保存。

蛋黃：取2ml新鮮蛋黃加2ml生理鹽水震蕩混勻，3000轉/分鐘離心15分鐘，取上清作為樣本。

3.用工作洗滌液將待檢血清、血漿或已處理蛋黃樣本按5倍稀釋（如10μl樣本加入40μl工作洗滌液中，混勻）。陰、陽性對照不用稀釋。

【檢驗方法】

1. 使用前將試劑盒置室溫30分鐘，恢復至室溫。

2.取所需用量酶標板條，設陰性/陽性對照各2孔，未用的板條盡快密封，2～8℃保存。

3.陰、陽性對照孔分別加入陰、陽性對照50μl；樣品孔每孔加入稀釋后的樣品50μl。

4.每孔加抗體工作液50μl，混勻，置37℃反應30分鐘。

5.甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，重復洗滌5次，拍干。

6.每孔加酶標記物100μl，置37℃反應30分鐘。

7.洗滌，同步驟5。

8.每孔依次加底物液A、底物液B各50μl，混勻，37℃避光反應15分鐘。

9.每孔加終止液50μl，混勻，于450nm(可用630nm作參比波長）測定各孔吸光值（A值）。

【參考值】實驗正常的情況下，陰性對照吸光值≥1.0，陽性對照吸光值≤陰性對照吸光值×50%。

【檢驗結果的解釋】

1. PI（阻斷率）=（1-樣本值/陰性對照孔均值）×100%，PI≥50%為陽性；PI＜50%為陰性。

2.未曾免疫雞群：結果為陽性時表明可能有感染，需結合臨床資料進行分析。

3.免疫雞群：監測并記錄樣本當時的抗體水平，根據結果分析抗體水平的分布及雞群免疫狀態的動向。

【試驗方法的局限性】

該試驗僅作為定性檢測新城疫病毒抗體，根據PI值高低可作抗體水平強、中、弱的粗略評估。

【注意事項】

1. 實驗操作時需戴手套、穿工作衣，嚴格健全和執行消毒隔離制度，各種實驗廢棄物都應按傳染物處理。

2.終止液具有腐蝕性，應避免接觸皮膚和衣物，如不慎接觸請立即用大量自來水沖洗。

3.酶標板從冷藏環境中取出時應恢復至室溫方可開袋，未用完的酶標板需放入有干燥劑的密封袋中保存。

4.濃縮洗滌液在低溫時容易結晶，使用時需恢復至室溫以完全溶解。

5.洗滌時各孔均需加滿液體，防止孔口有游離酶不能洗凈。

6.用于檢測的樣品應保持新鮮。

7.試驗結果的判定必須以酶標儀讀數為準。

8.不同批號試劑組分不得混用。