機體細胞免疫功能的檢測

實驗概要

本實驗用硝基藍四氮唑還原法檢查了機體細胞的免疫功能。硝基藍四氮唑，又稱四唑氮藍(nitroblue tetrazolium, NBT)，是一種水溶性的淡黃色活性染料，當其被嗜中性白細胞的酶還原后，則變為非水溶性的藍黑色甲月替(Formazan)顆粒,沉淀于胞漿內。當機體受細菌、真菌和寄生蟲感染時，嗜中性白細胞的吞噬能力明顯增強，還原NBT的能力亦隨之增高，但病毒性感染或非感染性疾病則不增高，故可利用NBT還原試驗作為診斷全身性感染的一種輔助方法，并作為判定嗜中性白細胞殺菌功能的指標，以診斷吞噬功能缺陷癥。一般認為在細菌感染過程中，嗜中性白細胞能量消耗驟增，氧的消耗量增加，己糖磷酸旁路糖代謝活性加強，葡萄糖分解的中間產物葡萄糖6磷酸在此旁路中脫氫氧化而成為戊糖。所脫出的氫被吞入或滲入胞漿內的NBT接受，則還原成為點狀或塊狀的藍黑色甲月替顆粒顆粒，沉積于細胞漿內。

主要試劑

1． 0.2% NBT溶液取10mg NBT置于棕色瓶內，加入5ml生理鹽水，于室溫下搖動1h，或放80℃水浴中攪拌或振蕩，促其溶解。溶液呈淡黃色，清亮，少量不溶的顆粒靜置后沉于瓶底，用時吸上清液。為避免不溶性顆粒(沉渣)影響試驗結果，亦可用濾紙將其過濾，置于4℃冰箱保存，有效期3～6個月。

2． 0.15mol磷酸鹽緩沖液(pH值7.2)取7.6g Na₂HPO₄及2.48g KH₂PO₄，加入適量生理鹽水，使其容積成500ml，調整pH值為7.2;亦可按每ml磷酸鹽緩沖鹽水加入1mg葡萄糖。混勻，過濾，113℃高壓滅菌20min，分裝，置4℃冰箱保存備用。

3． NBT應用液取上述0.2% NBT溶液與0.15mol磷酸鹽緩沖液等量混合。應用時現配。

4．肝素溶液每ml含126單位。

5． 1%沙黃(Safranin O)水溶液取沙黃1g，先加入1～2ml 95%酒精，邊振蕩邊加入98ml蒸餾水，使之逐漸溶解，過濾，濾液分裝于玻璃瓶內，室溫保存。

主要設備

小玻璃瓶，也可用青霉素瓶代替，每瓶加入1ml含126單位肝素0 1ml(即126單位)，加塞；小試管或凹玻片；毛細滴管；吹風機等。

實驗步驟

1．取靜脈血0.5~10ml，每ml按126單位加入肝素抗凝，肝素量不宜過大，否則會引起假陽性反應。

2．取上述抗凝血0.1ml，加入等量的NBT應用液，放入一凹玻片中，或放入12×75mm 塑料管或小試管，混勻，將管口蓋上。凹玻片可放于一浸濕紗布之平皿中，加蓋，置37℃溫箱，孵育25min，然后放室溫15min。試管可放37℃溫箱，其間振搖一次。孵育的方式很重要，如放置水浴中將會增加染料的還原能力。

3．將上述液體取出搖勻，用毛細滴管吸取1滴于玻片的一端作推片，要求推出尾部，推片要厚薄適宜。

4．立即用吹風機吹干，甲醇固定1~2min，吹干，用1%沙黃水溶液染色5min，也可用5%甲基綠水溶液染色15min，或用姬姆薩瑞氏染液染色，自來水沖洗，吹干，油鏡觀察，計數。

5. 結果判定

   1) 計數

      a． NBT陽性細胞的百分率計算100個嗜中性白細胞中NBT陽性細胞數。

      b． NBT陽性細胞總數NBT陽性細胞%×多核白細胞%×白細胞總數。故應同時推片作白細胞計數及分類，以計算出陽性細胞的絕對值，以避免誤差。計數時，應注意不要將聚集的或破壞的多核白細胞及單核細胞計算在內。

      c．沉著的甲月替顆粒形狀不一，有的呈大塊狀，有的呈點狀或放射狀。必須注意，單核細胞還原NBT的能力也很強，不應將其計算在NBT陽性細胞內。因此涂片要涂得較薄，以便清楚地看到甲月替沉著物，并能更好地區別嗜中性白細胞及單核細胞。

   2) 結果判定若血涂片中有10%以上的嗜中性白細胞能還原NBT，即為陽性反應。

注意事項

1. 要設對照NBT還原是吞噬細胞內多種酶引起的，必須用在0℃下的細胞作對照，借以排除因細胞溶解或其他原因釋放的酶所引起的非特異性反應。

2. 注意吞噬細胞代謝因素對試驗結果的影響因NBT還原與吞噬過程在時間上是一致的，所以要注意掌握染料開始被還原的時間(30min以內)，才能得到準確的結果。

3. 要除掉染料中未溶解的顆粒NBT染料在鹽水中不易溶解，故應注意除掉未溶解的染料顆粒，否則被吞噬細胞吞噬，將會影響試驗結果。