標記免疫分析技術1

一、標記分析技術概述
1959年，美國學者Yalow和Berson建立了放射免疫分析技術，這種技術以免疫反應的特異性，和放射性同位素標記的靈敏性顯示了其在微量檢測方面的優勢，吸引著各國的生物醫學工作者。標記免疫分析技術進入了一個嶄新的時期。從而使免疫分析，從定性分析和半定量分析走向了定量分析。醫學檢測技術也從常量分析走向微量與超微量分析。
標記免疫分析技術的優勢主要表現在兩個方面：1、高靈敏度：不是直接測定待測物而是探測待測物上的標記信號，利用標記物的放大效應，提高了信噪比，降低了待測物的可測下限。2、高特異性：以抗原、抗體作試劑替代了傳統的無機或有機試劑，使檢測特異性大大提高。

作為經典的標記免疫分析技術——放射免疫分析技術的缺點是：1、試劑穩定性欠佳，同位素的衰變影響結果。2、放射性污染問題。3、測定方法難以全自動化。
為了克服放射免疫分析技術的缺點，研制放射性同位素以外的標記物——拓寬體外微量分析技術，成了熱門的課題。此后酶、化學發光、生物發光、熒光標記等新標記不斷涌現，相應的標記免疫分析技術相繼問世。
標記分析技術的歷史沿革:
1923年 Hevesy：放射性核素示綜法。
1959 年 Yalow 和 Berson：放射免疫分析技術。 （Radioimmunoassay， RIA）
1986 年?Miles 和 Hales：免疫放射分析技術。
（immunoradiometricassay IRMA）
60年代 酶標記示蹤檢測技術（EIA，ELISA）
70年代 Halmann 和 Velan：化學發光免疫分析
（Chemiluminescence Immunoassay，CLIA）
1978年 Halman 和 Barach：化學發光酶免疫標記技術
1979年 Guesdon:生物素－親合素標記技術。
1979年 Soini 和 Hemmia：時間分辨熒光分析技術。

二、以酶作標記的免疫檢測技術
根據抗原或抗體的附著不同，可分為1、“板式酶標”——抗體與微孔板連接，應用得最普遍。2、“管式酶標”——抗體與試管連接，國內應用不多。3、“微粒子捕獲法”—— 抗體與微粒連接
各種酶標的特點：
1、板式酶標：孔間均一性欠佳，顯色體積太小，比色光徑不足，重復性不夠理想，精度難以達到ng以下，量程難以達到3個數量級。
2、管式酶標：增加了比色光徑與顯色體積，部分彌補了“板式酶標”之不足。如：美國ABBOTT公司的Commarder；德國BM公司的ES300；瑞士Serono公司的SR-1。
n ES -300采用鏈親和素包被管和生物素化抗體，以增加抗體結合量、增加放大效果。
n ES-300 采用了ABTS， SR-1采用了磷酸酚酞作顯色劑，大大提高了顯色穩定性。
n SR-1 采用異硫氰基熒光素（FTTC）連接第一抗體和通用的抗FTTC磁化顆粒作B/F分離。
3、微粒子捕獲法：微粒子的表面與抗體連接反應面積增加，檢測的量程增加。
根據底物不同可分為：1、酶免疫顯色；2、酶免疫熒光；3、酶免疫發光。
1、 酶免疫顯色：底物成色反應后，底物顏色在可見光范圍內。常用的底物有鄰苯二胺、甲基聯苯胺等。
2、 酶免疫熒光：酶反應的底物改為熒光底物。
（EIFA）
磷酸4-甲基傘型酮
↓
堿性磷酸酶
↓
發熒光的甲基傘型酮
（ABBOTT公司）

3、酶免疫發光：酶免疫反應的底物為發光底物
（EILA）
磷酸金剛烷
↓
堿性磷酸酶
↓
金剛烷
（不穩定，分解時發射光子）
（DPC公司）

三、熒光免疫分析：直接用熒光物質標記抗體或抗原
熒光物質有：
F 異硫氰基熒光素（FTTC）
F 四乙基羅丹明（RB 200）
F 四甲基羅丹明（RB 200）
F 稀土元素（銪(Eu)、鋱(Tb)、釤(Sm)和鏑(Dy)）
美國ABBOTT公司生產的藥物血濃度檢測儀TDX，即利用熒光標記藥物和樣品中藥物與抗體的競爭結合來進行測定，當藥物分子與抗體結合后，其在偏振光激發下產生偏振，而游離的標記物失去偏振。
鑭系元素標記的時間分辨熒光檢測技術（TRFIA或DELFIA），以具有雙功能基因的鑭系元素螯合物作示蹤劑，標記抗原或抗體，當解離下來的鑭系元素與特制的擴增液形成新的螯合物時，其熒光明顯增強而持久。用延遲測量的辦法可消除樣品自身的早期背景熒光而大大提高檢測靈敏度