比色法操作的注意事項

 噻唑藍（MTT）比色法操作注意事項

 噻唑藍（MTT）：四唑鹽

1. 原理：

   MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法.活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍紫色產物，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結晶物，溶液顏色深淺與活細胞數成正比。

2. 優點：簡單快速、靈敏、經濟

3. 缺點：由于MTT經還原所產生的甲瓚產物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結果的準確性產生影響，而且溶解甲的有機溶劑對實驗者也有損害。

4. 應用：新藥篩選、細胞毒牲試驗、腫瘤放射敏感性實驗等

5. MTT主要有兩個用途

   1）藥物（也包括其他處理方式如放射線照射）對體外培養的細胞毒性的測定；

   2） 細胞增殖及細胞活性測定。

6. 比色法操作注意事項

   1） 選擇適當的細胞接種濃度，保證細胞培養結束時濃度不至于過滿。

   2） 種板技術：均勻。

   3） 實驗時應設置調零孔，溶媒孔，加藥孔。

   調零孔：培養基、MTT、DMSO。（無細胞）

   溶媒孔：培養液、MTT、DMSO、細胞、溶酶。

   加藥孔：培養液、MTT、DMSO、細胞、不同濃度的藥物。

   （一般5-7個梯度，設3-5個復孔）

   4）避免血清干擾：一般選小于10%胎牛血清的培養液進行。

   5）邊緣效應：周邊孔加入PBS。

   6）MTT的配置： MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液。4℃下避光保存2周。

   7）孔板的重復利用（1.做完MTT后用大水流盡量將板沖凈，然后用洗衣粉水泡幾個小時（小心最好讓洗衣粉先化開）。2.用自來水沖凈洗衣粉水，倒扣晾
   干.3.重鉻酸鉀加濃硫酸配成的酸液中浸泡過夜泡洗液（六小時以上即可）后自來水洗凈（20次左右）每個孔都要處理4.用去離子水沖洗3遍，雙蒸水沖洗3
   遍，烤干5.超凈臺中紫外線照射2個小時左右，就可以用了，不可以高壓。或泡酸過夜，dd水沖洗干凈，烘干或者晾干后紫外照射30min以上即可使用。

   8）MTT法只能用來檢測細胞相對數和相對活力，但不能測定細胞絕對數。

   9）在用酶標儀檢測結果的時候，為了保證實驗結果的線性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范圍內。

   10）MTT有致癌性，用的時候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套。

   11）配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以操作臺上的照明燈關掉。