沃特世重新定義UHPLC和UPLC的新界限

　　2004年沃特世推出UPLC，帶動眾多液相色譜廠家，打造了一個更小顆粒、更高效率的液相色譜新市場，推動了液相色譜技術的進步。時隔11年后，沃特世推出ACQUITY Arc UHPLC，就像它的名字一樣，宛如一架拱橋，架起從傳統HPLC到UPLC的橋梁。HPLC大家都知道，那么問題來了，作為橋梁的UHPLC和UPLC有什么區別呢？

　　筆者查了很多解釋，獲得了對液相色譜前世今生的認識，但關于UHPLC和UPLC的區別都沒有明確的答案，近期我們采訪了沃特世中國市場發展部負責人葉瑞莉女士，她用新的分類方法和詳實的數據，為我們重新定義了UHPLC和UPLC的新界限。如果您對于這個問題也覺得迷惑，那么就請隨我們一起來探個究竟吧。

液相色譜發展史

　　LC(Liquid Chromatography)：1903年俄國植物化學家茨維特（Tswett）首次提出“色譜法”（Chromotography）和“色譜圖”（Chromatogram）的概念。然而受制造技術和理論發展緩慢的影響，之后液相色譜一度沉寂，沒有大步發展。

　　HPLC(High Performance Liquid Chromatography)：上世紀60年代，隨著氣相色譜理論和實踐發展，機械、光學、電子等技術上的進步，液相色譜又開始活躍。科克蘭（Kirkland）等人把高壓泵和化學鍵合固定相用于液相色譜，開發了世界上第一臺高效液相色譜儀（HPLC）；Waters公司隨后推出了世界上第一臺商品化的HPLC。隨著計算機技術的推動和HPLC理論的發展，HPLC已成為現代主流分析檢測儀器。同時與HPLC息息相關的色譜柱，也從最初的無定形顆粒，發展到全多孔顆粒，大大增強了分離效能。填料顆粒度由最初的100μm隨技術發展不斷減小，80年代普遍使用5μm全多孔硅膠，傳統HPLC將5μm填料顆粒的柱子的效能發揮到最佳。常見系統有島津Prominence HPLC，安捷倫1260VL，Waters Alliance。

　　UPLC（Ultra Performance Liquid Chromatography）：2000年初，Waters研發出更小粒徑亞2μm顆粒度的色譜柱，與5μm色譜柱相比，它可以幫助色譜工作者帶來更好的分離效果。然而常規的液相產品較大的擴散體積無法將亞2μm色譜柱的性能優勢體現出來，因此Waters公司推出了超高效液相系統（UPLC，Ultra Performance Liquid Chromatography）。UPLC具有超低擴散體積（小于15μL）可將亞2μm色譜柱性能發揮到極致。色譜工作者使用UPLC結合小顆粒色譜柱可以獲得更好的分離度，靈敏度，更快的分析速度。

　　UHPLC（Ultra High Performance Liquid Chromatography）： 在Waters UPLC 技術推出來之后，其他公司陸續推出超高壓液相系統， 比如Agilent公司就在2005年緊接著推出1200 RRLC 600bar 儀器。可以說，UHPLC的誕生是UPLC 對色譜分離技術帶來的一系列變化之一。UHPLC在制造技術，擴散體積和耐受壓力方面進行了優化，使之能夠匹配2.5～3.5μm顆粒度的柱子，最大限度發揮色譜性能。UHPLC是目前使用最為廣泛的液相色譜儀,常見系統多有安捷倫1260SL，島津Prominence UFLC，Thermo Ultimate3000。最近，Waters的ACQUITY Arc加入了這個陣營。

液相色譜的發展歷史

色譜填料的發展和色譜的發展緊密交織

　　要完成一個液相色譜方法，除了色譜儀器本身，色譜柱必不可少，它是色譜的靈魂，而色譜柱的核心就是色譜填料。順便說一句，筆者看到的事實是：如果只做色譜填料，或只做儀器，都不會成為分離科學領域頂尖的公司，那些牛×的公司都是兩者都做的，包括：Waters、Agilent、GE等等。因為客戶要的是整套方法，完整的性能，只有兩者都做，設計人員才能不斷在色譜填料性能達到更高時去調整儀器，根據不同的儀器性能再去設計不同的色譜填料，為的就是在某套配置、某種填料下，讓整套系統發揮最好的性能。

　　那么我們再來回顧一下色譜填料的發展歷史。

　　液相色譜儀剛出現時匹配的主要色譜柱填料是 10μm 無定型硅膠顆粒；后發展為5-10μm 的球形硅膠；上世紀 90 年代，出現了 3μm 或 3.5μm 粒徑的球形硅膠，能夠進行相對快速的分離，也對液相色譜系統性能產生了一定的要求；而而此后又由Waters公司率先研發出亞2μm的雜化顆粒色譜柱填料，極大的提高色譜柱分離性能。

最合適的匹配，才能有效發揮系統性能，獲得最佳分離效果

　　在實際使用上，要使色譜柱發揮最大分離效能，一定要選擇合適的液相色譜。下表是色譜柱和其最合適的色譜系統的關系。

填料粒徑	內徑	最合適	常規流速
5μm	4.6mm	普通HPLC	≤3mL/min
2-3.5μm	3.0mm	UHPLC	≤2mL/min
亞2μm	2.1mm	UPLC	≤1mL/min

關鍵問題：HPLC、UHPLC和UPLC的區別

　　怎樣為不同粒徑色譜柱選擇最匹配的液相色譜系統？這就回到了本文的重點：普通HPLC、UHPLC和UPLC到底應該怎么區分？

　　它們只是必要條件，不足以保證超高效分離

　　色譜的用途是分離，追求更高的分離性能是色譜的終極目標。那么區分HPLC、UHPLC、UPLC的關鍵點就是分離性能。

　　很多人會說，色譜柱填料粒徑小了不就分離性能高了么？

　　No！這是獲得高分離效能的一個必要條件。粒徑小了，只是柱內擴散體積小了。

　　市場上還有一個更混淆的解釋，只要能耐更高的壓力，比如到了15,000 PSI，那就是超高效液相色譜了。這就更是偷換概念，舍本逐末的說法。如要發揮更小粒徑填料的性能，可能會造成系統反壓增高，就需要系統耐受更高壓力。但造出耐受更高壓力的色譜系統不難，真正難的是：造出的系統能否發揮更小粒徑填料的性能，給客戶真正的超高效。

　　所以，不管是UHPLC，還是UPLC，最終追求的都是超高效，而不是超高壓。當然，超高壓也是一個必要條件：如不能耐受超高壓，那么系統運行小粒徑填料時，說不定會崩潰的！

　　充分必要條件到底是什么？

　　小粒徑、耐高壓都是超高效色譜系統的必要條件，那么達到充分必要條件的最后一環是什么？

　　首先我們先看看色譜峰是怎樣形成的。如下圖所示，分析物從進入系統開始到出檢測器得到信號，最后由計算機工作站處理得到了色譜峰。所以色譜峰是分析物在色譜系統里形成的譜帶。

色譜峰的形成

　　色譜峰峰寬隨著譜帶展寬而變寬，峰高隨之降低，同時伴隨著靈敏度和分離度的喪失。相反，如果譜帶展寬最小化，那么就能得到最高效的色譜行為，提高靈敏度和分離效率。

　　沒錯，上面這張圖很明顯，右邊的比左邊分離度高太多了，最重要的原因就是：右邊的系統具有較小的譜帶展寬。

　　色譜峰的譜帶展寬又與哪些因素相關呢？譜帶之所以展寬，必然是系統內有允許譜帶展寬的空隙，分析物從進入系統開始到出檢測器，其間經過的所有空隙體積都會引起展寬。所有空隙體積的總和，就是系統的譜帶展寬體積。譜帶展寬體積是色譜系統的一個極為重要的參數。

　　譜帶展寬體積包括兩部分，一是柱內擴散體積，另一個是柱外擴散體積。柱內擴散體積一般和色譜柱的物理參數、粒徑、內徑和長度直接相關，小粒徑的色譜柱擴散體積小（前文已經說明了：小粒徑填料是獲得超高效的一個必要條件）。而柱外擴散體積一般包括目標物經過的管路，接口和檢測池的體積，可以看出，柱外擴散體積和色譜系統性能息息相關。

　　結論就是：

　　獲得超高效分離性能的最后一個必要條件是：更低的柱外擴散體積。

　　只有：小粒徑填料+超高壓+更低柱外擴散體積，才能獲得完美的超高效分離。這三者聯合構成了超高效色譜的充分必要條件。

　　下圖對比了某商用系統（系統耐壓>20,000 PSI，但廠家未公布柱外擴散體積數據）和Waters ACQUITY I-Class UPLC的區別。可以明顯看到，I-Class柱外擴散體積更小，可以更充分地發揮亞2μm粒徑填料的效果，獲得更優秀的分離效果。

　　HPLC、UHPLC、UPLC的柱外擴散體積對比

　　借推出ACQUITY Arc UHPLC之際，Waters重新定義了HPLC、UHPLC和UPLC的界限。下表用以比較三種類別液相色譜的差異。

	HPLC	UHPLC	UPLC
擴散體積	>30μL	15 - 30 μL	< 15 μL
色譜柱	3.0-4.6 mm內徑3-10 μm顆粒選擇 代表：4.6mm內徑, 5μm	2.1-4.6 mm內徑1.7-5 μm顆粒選擇 代表：3.0 mm內徑，2-3.5μm 實心核顆粒色譜柱	1.0-4.6 mm內徑1.6-5 μm顆粒選擇 代表：2.1 mm內徑，亞2μm
最高耐壓	<6,000 PSI	≥9,000 PSI	≥15,000 PSI
代表系統，顯示擴散體積和最高耐壓	Alliance 34 μL，6,000 PSI Prominence  35 μL， 6,000 PSI	ACQUITY Arc 25 μL，9,500 psi Agilent 1260 Infinity  25 μL，9,000 PSI	ACQUITY UPLC  10 μL，15,000 PSI H-Class 7 μL,15,000 PSI I-Class 5 μL,18,000 PSI

　　用文字總結為三大標準：

　　HPLC高效液相色譜：擴散體積>30μL，最高耐壓<6,000 PSI的液相色譜系統，最適宜色譜柱粒徑是5μm；

　　UHPLC超高效液相色譜：擴散體積15  -30 μL，最高耐壓≥9,000 PSI的液相色譜系統，最適宜色譜柱是粒徑粒2-3.5μm的實心核顆粒色譜柱；

　　UPLC（超效能液相色譜，這中文名字是筆者自己取的，還麻煩大家再取個合適的名字）：擴散體積<15 μL，最高耐壓≥15,000 PSI的液相色譜系統，最適宜色譜柱粒徑是 <2μm；

　　至于上述各種類型色譜給用戶帶來的不同感受，大家可回顧和參考超高效液相色譜的好處：更高分離度、更高效率、更快速度、更省溶劑、更環保、更適合連接質譜等等。

為什么說是重新定義？

　　本文寫到此處，讀者可能會問：為什么說Waters重新定義了UPLC和UHPLC的界限呢？

　　2004年Waters在推出UPLC之時，UPLC作為一個產品名稱為ZL所有，之后其他廠家推出的超高效液相色譜系統通稱為UHPLC。在很長一段時間里，市場上將超高效液相色譜統稱為UHPLC/UPLC，各家也推出了從低到高的各種系統配置。

　　正如達爾文的進化論所述：物種進化的趨勢是分化，那么產品品類最終也要趨于分化， Waters用ACQUITY Arc UHPLC把UPLC和UHPLC拆分為兩個品類，并建立了衡量的3大標準：耐壓程度、柱外擴散體積、最適宜的色譜柱粒徑。

新產品ACQUITY Arc UHPLC

　　讓我們在此回顧一下新產品ACQUITY Arc UHPLC的特征：

ACQUITY Arc UHPLC

　　ACQUITY Arc系統是一套具有四元溶劑管理器的現代液相系統，用以填補HPLC和UPLC之間的性能差距，適用于在使用現有方法和已經驗證過了的試驗的同時，尋求功能全面及性能穩定的科學家們。

• 真正的“即插即用”方法兼容性：基于Arc Multi-flow path技術，只需一個切換即可實現在HPLC和UHPLC分離之間的轉換
• UHPLC方式下，將2-3 μm顆粒色譜柱的效能最大化，提高方法的色譜性能
• 一鍵啟動的質譜檢測：使用ACQUITY QDa檢測器
• 提供完整的LC檢測器：包括光電二極管陣列、UV/Vis、熒光、示差折光和蒸發光散射檢測器。
• 梯度程序中直接輸入pH值和離子強度：使用Auto●Blend Plus技術，通過改變溶劑混合比例實現pH最小增量的增加；避免了繁瑣的手動配制流動相并減少人為誤差。
• 極低的交叉污染（<0.002%）：先進的FTN模式可通過運行中一直沖洗針內壁來最小化交叉污染。

　　對于喜愛Waters的用戶，Waters提供了3類液相。如果只需要HPLC，請選擇Alliance這款經典之作；如果需要UHPLC或同時需要HPLC和UHPLC，請選擇ACQUITY Arc；如果需要超級的性能，請選擇ACQUITY UPLC系列，包括四元的H-Class和二元的I-Class。

　　最后，筆者提出兩個愿望：

　　1、ACQUITY Arc UHPLC的性能雖好，但希望價格也好，尤其是：針對中國用戶的價格要好。

　　2、Waters可以在UPLCZL到期后轉成公共詞匯，只有讓更多的供應商能夠使用UPLC這個名稱，UHPLC和UPLC才能真正從拗口的UPLC/UHPLC中分化出兩個品類。市場的領導者，一定會建立品類，并允許讓更多的競爭者進來，一同把品類做大做強。