淺談NGS的這10年（二）

　　邊連接邊測序（SOLiD和Complete Genomics）

　　從 根本上來說，SBL法包含了雜交和對標記的探針的連接15。探針包含了一到兩個特定堿基序列和一系列通用序列，這可以使得探針與模板之間進行互補配對。錨 定的片段則包含一段已知的和接頭互補的序列用于提供連接位點。連接之后，模板被系統進行測序反應16。在錨和探針復合物或者熒光基團被完全移除之后，也或 者連接位點重新生成之后，新的循環又重新開始了。

　　SOLiD平臺使用的是雙堿基編碼的探針，每個熒光基團信號代表了一個二核糖核酸17。因 此，原始輸出的數據并非直接和已知的核糖核酸相連。因為有16種可能的二核糖核酸組合并不能單獨結合熒光基團。每四種組合使用一種熒光信號，共有四種熒光 信號。所以，每種連接信號代表了幾種可能的二核糖核酸組合。SOLiD測序過程由一系列的探針-錨的結合，連接，圖像獲取以及切割的循環組成。

　　Complete Genomics使用探針-錨的連接方式（cPAL）或者探針-錨的合成方式（cPAS）來進行測序14。在cPAL中（圖2b），錨的序列（與四種接頭 序列其中之一的互補）以及探針雜交到DNA微球的不同位置。每個循環中，雜交探針是一組特定位置已知堿基序列的探針的一員。每個探針包涵一段已知序列的堿 基以及對應的熒光基團。獲取圖像之后，全部的探針-錨復合物被移除，新的探針-錨復合物被雜交。cPAS方法是cPAL的修改版，增加了read的長度； 然而，目前來說，該方法還是有局限性的。

　　圖2: SBL測序原理。

　　邊合成邊測序（Sequencing-by-synthesis）

　　SBS 的方法是指那些依賴于大量的DNA聚合酶來進行測序的方法。但是，SBS中依然包括了各種不同的測序原理。本文中，SBS方法被分為循環可逆終止 （Cyclic reversible termination, CRT）以及單核糖核酸增加（single-nucleotide addition, SNA）18。

　　邊合成邊測序：CRT（Illumina，Qiagen）

　　CRT 方法是根據類似于Sanger測序的終止反應來界定的，其3'-OH基團被屏蔽而被阻止繼續延伸19,20。在反應開始時，DNA模板被一段和探針序列互 補的接頭結合，DNA聚合酶也是從這段序列開始結合。每個循環過程中，四種單獨標記的復合物和3'屏蔽的脫氧核糖核酸被添加進反應中。在延伸過程中每結合 一個dNTP，其他沒有被結合的dNTPs被移除，并且獲取圖像來確定是那個堿基在某個簇中被結合。熒光基團以及屏蔽基團隨后被移除并且開始一輪新的反 應。

　　Illumina的CRT和其他平臺相比，代表了最大的測序平臺市場。Illumina短讀長測序的設備可以從臺式的低通量單位到大型 的超高通量，如應用于全基因組關聯分析（whole-genome sequencing，WGS）。dNTPs是通過兩個或者四個激光通道來對熒光進行分析的。在絕大多數Illumina平臺上，每種dNTP結合一種熒 光基團，因此需要四種不同的激光通道。而NextSeq和Mini-Seq則使用的是雙熒光基團系統。

　　圖3: SBS測序原理。

　　2012 年，Qiagen獲得了Intelligent BioSystems CRT平臺，并且在2015年將該平臺命名為GeneReader重新推出并且使之商業化22（圖3b）。與其他平臺不同的是，該平臺打算做一站式的 NGS平臺，從樣本制備到數據分析，全部一站式解決。為此，GeneReader系統整合了QIAcube樣本制備系統和Qiagen Clinical Insight平臺用于不同的數據分析。GeneReader平臺的技術原理與Illumina平臺基本一致。然而，該平臺并非讓每個DNA模板都去結合 帶有熒光基團的dNTPs23，而是只要足夠的dNTPs結合到模板上就可以完成鑒定。

　　邊合成邊測序：SNA（454，Ion Torrent）

　　與 CRT不同的是，SNA方法依賴于單信號標記dNTP來對鏈進行延伸。四種核糖核酸都必須反復添加到測序反應過程中。不僅如此，SNA不需要將dNTP屏 蔽，因為測序反應過程中下一個堿基的缺失會阻止鏈的延伸。堿基的寡聚體則是一個例外，在這種情況下，信號的強度會隨著dNTP數量的增加而成比例的增強。

　　第 一個NGS儀器是454焦磷酸測序儀24。這種SNA系統將結合有模板的珠子以及酶混合物分配到PicoTiterPlate中。由于一個dNTP只能結 合到一條鏈上，酶復合物會對其產生生物熒光。一個特定的珠子中的一個或多個dNTPs可以通過電荷共軛偶聯設備（charge-coupled device, CCD）檢測到的熒光來確認（圖4a）。

　　Ion Torrent是第一個沒有光學感應的NGS平臺25。與酶化學復合物產生的信號相比，Ion Torrent平臺檢測的是dNTP中釋放出來的H離子。pH值的改變通過（integrated complementary metal-oxide-semiconductor，CMOS）以及（ion-sensitive field-effect transistor，ISFET）來檢測（圖4b）。傳感器對pH的變化對于連續堿基的檢測還不夠完善，因此在測量同一堿基連續出現時的數量可能會有所 誤差。

　　圖4: 邊合成邊測序：單核糖核酸添加法。

　　短讀長平臺的比較

　　每 個平臺在通量，成本，錯誤率以及read結構上都大相徑庭（表一）。盡管有多家NGS技術供應商，NGS研究最常用的還是Illumina平臺21。盡管 該平臺極為穩定，數據可靠，但是基于其使用的單一測序的方法26-28，既然具有系統偏好性的問題。因此，新技術的發展使得研究人員能夠有完整的測序方案 來獲得完整的序列信息。

　　SOLiD與Complete Genomics系統使用的SBL技術準確率非常高（~99.999%）7,14,因為每個堿基都會被標記多次。雖然這些技術非常準確，但是在敏感性與特 異性之間依然不能達到完美的平衡，當一些錯誤的堿基變化出現時，真實的堿基變化可能被忽略29-31。該類技術在應用上最大的限制可能就是其過短的讀長。 盡管所有的平臺都能產生單末端和雙末端的reads，SOLiD的最大讀長只能達到75bp，Complete Genomics只能達到28-100bp33，使得其在基因組拼接和結構變異研究中的可操作性大大降低。不幸的是，SOLiD系統不僅受制于運行時間， 還受制于其工業生產。另外，盡管cPAL計劃準備在成本和通量上和Illumina競爭，卻在2016年被迫下馬，該技術僅在人類WGS中有所應用 33,34。cPAS的BGISEQ-500系統則受制于中國大陸政府。

　　Illumina由于其技術成熟，平臺之間高度互補性與交叉性，使 得其在短讀長測序上大占優勢。Illumina的產品覆蓋了從低通量的Mini-Seq到超高通量的HiSeq X系列，其中HiSeq X系列最多可以在一年內產生1800多個30×覆蓋度的人類基因組數據量。此外，其運行時間，read結構以及read長度（最大300bp）都在不停的 改進。但是，作為一個依賴于CRT技術的Illumina平臺，相對于SNA平臺的優勢在于其在讀取核糖核酸多聚體（同一種核糖核酸多次出現）時較低的錯 誤率。盡管SNA平臺總體上的準確率可以達到99.5%35，但是在讀取那些高AT富集或者高GC富集的片段的時候錯誤率差強人意32,37,38。在 2008年，據Bentley等報道，Illumina平臺鑒定到的人類單核糖核酸多態性（SNPs）與基因芯片鑒定的SNPs具有驚人的一致性35。但 是，這種高度的敏感性也隨之帶來了2.5%左右的錯誤率。因此，其他小組計劃使用Sanger測序來對鑒定到的SNPs進行重新測序以便區分測序錯誤導至 的SNPs與真實的基因突變導至的SNPs35,39,40。在對所有的可能性都進行優化之后，Illumina平臺被大量的研究人員認可，在大量的領域 中均有涉及：WGS的基因組測序與外顯子測序；遺傳學應用如染色質免疫共沉淀——測序（chromatin immunoprecipitation followed by sequencing）41；ATAC-Seq（transposase-accessible chromatin using sequencing）42或者DNA甲基化測序（Methyl-Seq）43；RNA轉錄組測序（tranomics applications through RNA sequencing, RNA-seq）44等等。NextSeq與MiniDeq平臺使用的雙色標記系統通過降低雙色通道的掃描與熒光基團的使用達到成本并且增加測序速度。然 而，雙通道系統卻會略微增加測序的錯誤率45。HiSeq X是目前最高通量的儀器，但其由于通量過大，因此只在部分應用上得以使用，如WGS與全基因組甲基化測序。不僅如此，HiSeq X更大的局限在于其高昂的成本，以至于超過了絕大多數單位的可接受程度。

　　Qiagen的GeneReader是專為臨床診斷設計的，其主要 關注點在腫瘤基因panels46上，也因此其局限性較大。根據對其運行時間與功能的分析，GeneReader與Illumina的MiSeq較為相似 46。盡管還沒有使用數據，但是GeneReader和MiSeq平臺有相同的優缺點。