磁珠法分離T細胞和B細胞

基 本 方 案 1 用 AUTOMACS 系 統 進行 總 T 細胞、 CD4 + 細 胞 或 CD8+T細胞的自動分離

材 料

小鼠

HBSS 洗滌緩沖液

基 本 方 案 2 使 用 AUTOMACS 系 統 進 行 B 細胞的自動分選

材 料

小鼠

HBSS 洗滌緩沖液

MACS 緩沖液

CD45R (B2 2 0 ) 磁 珠（Miltenyi)

RPMI-10 完全培養基

autoMACS 系 統 和 分 選 柱（Miltenyi)

30um 尼 龍 網（BD) 或 40/xm 預 分 離 濾 膜（Miltenyi)

1 . 用 2 只小鼠的脾臟制備單細胞懸液并去除紅細胞（單 元 2.1)。

2.將細胞在 10 ml HBSS 洗滌緩沖液中混懸后用血細胞計數器計數（附 錄 3A)。

3.將細胞懸液在 4℃， 20og離心 10min。棄上清后將沉淀按每 108 個細胞 0.9ml MACS緩沖液的比例混懸。每 108 個細胞加入 0.1ml CD45R(B220) 磁珠后在 4℃孵育 15 min

4.按基本方案 1 中的步驟 4?7 操作，這樣 B 細胞將從陽性通道洗脫。

基 本 方 案 3 使 用 AUTOMACS 系統進行輔助細胞的自動分選

材 料

小鼠

HBSS 洗滌緩沖液

MACS 緩沖液

CD90 (Thyl.2 ) 磁 珠（Miltenyi)

RPMI-IO 完全培養基

autoMACS 系統和分選柱（Miltenyi)

30um 尼 龍 網（BD) 或 40um 預分離濾膜（Miltenyi)

1.用 2 只小鼠的脾臟制備單細胞懸液并去除紅細胞（單元 2.1)。

2.將細胞在 IOml HBSS 洗滌緩沖液中混懸后用血細胞計數器計數（附錄 3A)。

3.將細胞懸液在 4°C， 200 g 離心 lOmin。棄上清后將沉淀按每 IO8 個細胞 0. 9 mlMACS緩沖液的比例混懸。每 1 〇 8 個細胞加入0.1ml CD90 (Thy1.2) 磁珠后在 4℃孵育 15 min

4.除了選擇 depletes 程 序（非 possel 程序），其他操作按基本方案 1 中的步驟 4?7 進行，這樣輔助細胞將從陰性通道洗脫。

備 選 方 案 1 用磁性分選柱手工操作分離淋巴細胞

附 加 材 料（其 他 材 料 見 基 本 方 案 1 )

不含氣體的 MACS 緩沖液， 4°C (在上樣和洗柱過程中保持冰冷）

Midi MACS 分離磁鐵、 MACS 多用支架、 LS 或 LD 分 選 （Miltenyi)

15 ml 離心管，無菌

la. 對于分離總 T 細胞， CD4+ T 細胞或 CD8+ T 細胞：按前述方法制備并標記單細胞懸 液（見基本方案 1， 1?3 步）。

lb. 對于分離 B 細胞：按前述方法制備并標記單細胞懸液（見基本方案 2 , 步驟 1?3)。

lc. 對于分離輔助細胞：按前述方法制備并標記單細胞懸液（見基本方案 3 , 步驟1?3

2.將細胞懸液在 4°C， 200 g 離心 lOmin。

3.離心期間，將 Midi MACS 分離磁鐵安裝到 MACS 多用支架上，并將 LS 分選柱（用于分離總 T 細胞、 CD4+T 細胞、 CD8+T 細胞或 B 細胞）或 LD 柱（用于分離輔助細胞）放到磁體中，在分選柱下放一支無菌的 15 ml 離心管。用 4°C 不含氣體的 MACS緩沖液沖洗分選柱 3 次，每次 3 ml。棄洗脫液，在分選柱下方放置一支干凈的無菌離心管。

基 本 方 案 4 用 AUTOMACS 系統自動 分 選 CD4 +CD2 5+ 抑制性細胞

由此方法得到的陰性細胞（CD4+CD2 5- ) 可用作反應細胞或對照細胞。

備 選 方 案 2 用磁性分選柱手工操作分離 CD4 +CD25+抑制性細胞

附 加 材 料（其 他 材 料 見 基 本 方 案 4)

不含氣體的 MACS 緩沖液， 4°C (在上樣和洗柱過程中保持冰冷）

Midi MACS 分 離 磁 鐵（Miltenyi)

MACS 多 用 支 架（Miltenyi)

LD 分 選 柱（Miltenyi)