細胞培養中支原體污染的檢測方法

細胞培養中最令人頭疼的問題之一是支原體的污染。在人們日常生活工作環境中，支原體無處不在，它可以通過人的毛發、口腔、穿著的衣服、動物的皮毛以及日常的細胞培養的操作環境造成對細胞污染。
據說有11%的細胞株均受到不同程度的支原體污染，更有統計細胞培養中支原體感染發生率達到63%，對實驗結果會產生不可預期的影響。而支原體污染的癥狀不如細菌、真菌、霉菌污染比較容易辨認，一般需要借助其他手段，如PCR、熒光染色試劑盒、培養菌落等方法。

造成細胞污染的支原體有很多，但主要有四種支原體：口腔支原體、精氨酸支原體、豬鼻支原體和萊氏無膽甾原體。由于支原體體積很小，直徑約在0.2-2.0um之間，可以通過濾膜而直接造成培養基或血清的污染。另外，被支原體污染的細胞培養基液體往往并不渾濁，細胞受損程度并不明顯，形態很少改變，這樣就更增加 了人們對其的防范難度。

從形態結構上，支原體形態多變，它多吸附在細胞表面或散于細胞與細胞之間。從其理化或生物學特性上講，所有支原體代謝均需膽固醇，部分需要精氨酸和葡萄糖。支原體的生存要求比細菌高，同時，除需基本營養物質外，還需10-20%血清，最適pH值在7.8-8.0之間，多數支原體呈兼性厭氧，其繁殖方式主要是二分裂繁殖，分裂和其DNA復制不同步，可形成多核長絲體。

由于支原體是一類缺乏細胞壁的微生物，因此它對作用于細胞壁類的抗生素（如青霉素G）不敏感。支原體對熱的抵抗力和細菌相似，而對環境滲透壓的變化比較敏感。支原體對細胞的影響，可以從兩方面考慮。一方面是對細胞的直接影響，細胞被支原體污染后，增殖緩慢，部分細胞變圓，從瓶壁上脫落，部分細胞雖然表面變化不十分明顯，實際上潛伏著多方面的危險。另一方面，支原體可以通過消耗培養基中的精氨酸，抑制細胞DNA、RNA的合成，降低細胞的抵抗力。因此，支原體污染對細胞的影響是非常廣泛和深遠的。

由于支原體種類不同，應采取不同的方法進行檢測，常用的方法有如下幾種：

1、觀察細胞的形態和生長特征：支原體污染比較嚴重時可出現生長減慢，有的培養基pH明顯變酸，并出現細胞病變，其病變特征與病毒感染相似，因此不能準確診斷。

2、分離培養法：大多數支原體可出現特有的典型菌落。該方法準確、可靠，但時間長。 但其實驗周期較長，所以常用于進行對懷疑細胞的最后甄別。

3熒光染色法（DNA染色法）：此法快捷、簡便、價廉，但其靈敏度有一定欠缺，易造成漏檢，若細胞片制備不當則結果難以判斷。

4、PCR法檢測支原體：最為快速、靈敏，取樣量少，既可進行細胞檢測也可進行細胞上清的檢測，同時可以檢測8種支原體的污染，是目前常用的檢測手段。但其成本較高，條件要求嚴格，有時易出現假陽性。

5、電子顯微鏡和免疫電子顯微鏡法：此法非常直觀、準確，但對使用環境要求高，操作復雜，實驗周期較長，敏感性不高，常作為樣品的最后定性檢測。

6、間接免疫熒光法和免疫印跡：簡便、快速、特異性強，如果應用單克隆抗體試劑，效果會更好。

7、其他方法 ：放射性核素摻入法、放射自顯影法、基因探針法等。