細胞培養的前期準備

一.常用設備  

準備室的設備：

單蒸餾水蒸餾器、雙蒸餾水蒸餾器、酸缸、烤箱、高壓鍋、儲品柜（放置未消毒物品）、儲品規（放置消毒過的物品）、包裝臺。

配液室的設備：

扭力天平和電子天平（稱量藥品）、PH計（測量培養用液PH值）、磁力攪拌器（配置溶液室攪拌溶液）。

培養室的設備：

液氮罐、儲品柜（存放雜物）、日光燈和紫外燈、空氣凈化器系統、低溫冰箱（-80℃）、空調、二氧化碳缸瓶、邊臺（書寫實驗記錄）。必須放在無菌間的設備：離心機（收集細胞）、超凈工作臺、倒置顯微鏡、CO₂孵箱（孵育培養物）、水浴鍋、三氧消毒殺菌機、4℃冰箱（放置serum和培養用液）。

二.無菌操作

無菌室的滅菌：

1. 定期打掃無菌室：每周打掃一次，先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺等，然后用3‰來蘇爾或者新潔爾  滅或者0.5％過氧乙酸擦拭。

2.CO2孵箱（培養箱）滅菌：先用3‰新潔爾滅擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％過氧乙酸，再用紫外燈照射。

3.實驗前滅菌：打開紫外燈、三氧殺菌機、空氣凈化器系統各20-30分鐘。

4.實驗后滅菌：用75％酒精（3‰新潔爾滅）擦拭超凈臺、邊臺、倒置顯微鏡的載物臺。

實驗人員的無菌準備：

1. 肥皂洗手。

2.穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、放好拖鞋

3.用75％酒精棉球擦凈雙手。

無菌操作的注意事項：

1. 凡是帶入超凈工作臺內的酒精、PBS、培養基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面。

2.靠近酒精燈火焰操作。

3.器皿使用前必須過火滅菌。

4.繼續使用的器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時仍要過火。

5.各種操作要靠近酒精燈，動作要輕、準確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。

6.吸取兩種以上的使用液時要注意更換吸管，防止交叉污染。

三.器械的清洗和消毒

玻璃器械洗消：

(1)新的玻璃器皿的洗消：

1. 自來水刷洗，除去灰塵。

2.烘干、泡鹽酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀鹽酸中12小時以除去臟物、鉛、砷等物。

3.刷洗、烘干：12小時后立即用自來水沖洗，再用洗滌劑刷洗，自來水沖干凈后用烤箱烘干。

4.泡酸、清洗：用清潔液（重鉻酸鉀120g：濃硫酸200ml：蒸餾水1000ml）浸泡12小時，然后從酸缸內撈出器皿用自來水沖洗15次，最后蒸餾水沖洗3-5次和用雙蒸水過3次。

5.烘干、包裝：洗干凈后先烘干，然后用牛皮紙（油光紙）包裝。

6.高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內蓋好蓋子，打開開關和安全閥，當蒸氣成直線上升時，關閉安全閥，當指針指向15磅時，維持20-30分鐘。

7.高壓消毒后烘干

(2)舊的玻璃器皿的洗消：

1．刷洗、烘干：使用過的玻璃器皿可直接泡入來蘇爾液或洗滌劑溶液中，泡過來蘇爾溶液（洗滌劑）的器皿要用清水刷洗干凈，然后烘干。

2.泡酸、清洗：烘干后泡入清潔液（酸液），12小時后從酸缸內撈出器皿立即用自來水沖洗（避免蛋白質干涸后粘附于玻璃上難以清洗），再用蒸餾水沖洗3次。

3.烘干、包裝：洗干凈的器皿烘干后取出用牛皮紙（油光紙）等包裝，以便于消毒儲存及防止灰塵和再次被污染。

4.高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內，蓋好蓋子，打開開關和安全閥，隨著溫度的上升安全閥冒出蒸氣，當蒸氣成直線冒出3-5分鐘后，關閉安全閥，氣壓表指數隨之上升，當指針指向15磅時，調節電開關維持20-30分鐘即可。（玻璃培養瓶消毒前可將膠帽輕輕蓋上）

5.烘干備用：因為高壓消毒后器皿會被蒸氣打濕，所以要放入烤箱內烘干備用。

金屬器械洗消：

金屬器皿不能泡酸，洗消時可先用洗滌劑刷洗，后用自來水沖干凈，然后用75％酒精擦拭，再用自來水，然后用蒸餾水沖洗，再烘干或空氣中晾干。放入鋁制盒內包裝好在高壓鍋內15磅高壓（30分鐘）消毒，再烘干備用。

橡膠和塑料：

橡膠和制品通常處理方法是：先用洗滌劑洗刷干凈，再分別用自來水和蒸餾水沖干凈，再用烤箱烘干，然后根據不同品質進行如下的處理程序。

1. 針式濾器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小時,或者煮沸20分鐘,在包裝之前要裝好濾膜兩張，安裝濾膜時注意光面朝上(凹向上)，然后將螺旋稍微擰松一些，放入鋁盒中在高壓鍋內15磅30分鐘消毒，再烘干備用。注意在超凈臺內取出使用時應該立即將螺旋旋緊。

2. 膠塞烘干后用2％氫氧化鈉溶液煮沸30分鐘（用過的膠塞只要用沸水處理30分鐘），自來水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液30分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。最后裝入鋁盒內高壓消毒，烘干備用。

3. 膠帽，離心管帽烘干后只能在2％氫氧化鈉溶液中浸泡6-12小時（切記時間不能過長），自來水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液30分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。最后裝入鋁盒內高壓消毒，烘干備用。

4. 膠頭可用75％酒精浸泡5分鐘，然后紫外照射后使用即可。

5.塑料培養瓶，培養板，凍存管：

6.其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸氣消毒，可用70％酒精浸泡消毒。塑料培養皿打開蓋子，放在超凈臺臺面上，直接暴露在紫外線下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用2—3周時間洗除殘留的氧化乙烯。用20000—100000rad的r射線消毒塑料制品效果最好。

為了防止清洗器材已消毒與末消毒發生混淆，可在紙包裝后，用密寫墨水作好標記。其法即用沾水筆或毛筆沾以密寫墨水，在包裝紙上作一記號，平時這種墨水不帶痕跡，一經高溫，即出現字跡，從而可以判定它們是否消毒。密寫墨水的配制：氯化鉆(CoC₁₂·6H2o)2g，30％鹽酸10m1，蒸餾水88m1。

注意事項：

1. 嚴格執行高壓鍋的操作規程：高壓消毒時，先檢查鍋內是否有蒸餾水，以防高壓時燒干，水不能過多因為其將使空氣流暢受阻，會降低高壓消毒效果。檢查安全閥是否通暢，以防高壓時爆炸。

2.安裝濾膜時注意光面朝上：注意濾膜光滑一面是正面，要朝上，否則起不到過濾的作用。

3.注意人體的防護和器皿的完全浸泡：A.泡酸時要戴耐酸手套，防止酸液濺起傷害人體。B.從酸缸內撈取器皿時防止酸液濺到地面，會腐蝕地面。C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有氣泡，以防止泡酸不徹底。