細胞培養常見問題解答（二）

16 細胞欲冷凍保存時， 細胞冷凍管內應有多少細胞濃度?

冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml vial， 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。

17 應如何避免細胞污染?

細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好之細胞來源和培養基配制是減低污染之方法。

18 如果細胞發生微生物污染時，應如何處理?

直接滅菌后丟棄之。

19 支原體(mycoplasma) 污染的細胞， 是否能以肉眼觀察出異狀?

不能。除極有經驗之專家外，大多數遭受支原體污染的細胞株，

無法以其外觀分辨之。

20 支原體污染會對細胞培養有何影響?

支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數， 代謝及研究之任一數據。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結果之數據方有意義。

21 偵測出細胞株有支原體污染時， 該如何處理?

直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細胞株。

22 CO2 培養箱之水盤如何保持清潔?

定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。

23 為何培養基保存于4 °C 冰箱中，顏色會偏暗紅色， 且pH值會越來越偏堿性?

培養基保存于4 °C 冰箱中， 培養基內之CO2 會逐漸溢出，造成培養基越來越偏堿性。而培養基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養基偏堿之結果， 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養基偏堿時， 可以通入無菌過濾之CO2， 以調整pH 值。

24 各種細胞培養用的dish，flask是否均相同?

不同廠牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 雖對大部分細胞沒有太大之影響，惟少數細胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異。

25 購買之細胞冷凍管經解凍后，為何會發生細胞數目太少之情形?

研究人員在冷凍細胞之培養時出現細胞數目太少， 大都是因為離心過程操作上的失誤， 造成細胞的物理性損傷， 以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心， 應待細胞生長隔夜后再更換培養基即可。

26 購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因?

研究人員在細胞培養時出現存活率不佳， 常見原因可歸納為：培養基使用錯誤或培養基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后， 加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養溫度使用錯誤。細胞置于–80 °C 太久。

27 收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因?

冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現象，冷凍管有可能因此而造成細胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時，均應立刻將冷凍管再一次扭緊。

另：這里補充一下培養用品的消毒，供參考：

細胞培養的zui大危險是發生培養物的細菌，真菌和病毒等微生物的污染，污染主要是由于操作者的疏忽而引起，常見的原因有操作間或周圍空間的不潔，培養器皿和培養液消毒不合格或不徹底，由于有關培養的每個環節的失誤均能導致培養失敗，故細胞培養的每個環節都應嚴格遵守操作常規，防止發生污染。

消毒方法分為三類：

(A) 物理滅菌法(紫外線、濕熱、過渣等);

(B) 化學滅菌法(各種化學消毒劑);

(C) 抗生素。

(1)紫外線消毒：用于空氣，操作臺表面和不能使用其它法進行消毒和培養器皿。紫外線直接照射方便、效果好，經一定的時間照射后，可以消滅空氣中大部分細菌，培養室紫外線燈應距地面不超過2.5米，且消毒進物品不宜相互遮檔，照射不到的地方起不到消毒作用。

紫外線可產生臭氧，污染空氣，試劑及培養液都有不良影響，對人皮膚也有傷害，不宜近照射也進行實驗操作。

(2)溫熱消毒：即高壓蒸氣消毒，是一種使用zui廣泛、效果的消毒方法。溫熱消毒時，消毒物品不能裝得過滿，以防止消毒器內氣體阻塞而千百萬危險，保證其內氣體的流通。在加熱升壓之前，先要打開排氣閥門排放消毒器內的冷空氣，冷氣空氣排出后，關閉排氣閥門，同時檢驗安全閥活動自如，繼后開始升壓，當達到所需壓力時，開始記算消毒時間。消毒過程中，操作者不能離開工作崗位，要定時檢查壓力及安全，防止消毒及表皮意外事件發生。

常用物品消毒壓力及時間：

培養液、橡膠制品、10磅10分鐘;

布類、玻璃制品、金屬器械、18磅20分鐘。

上兩種是zui常見的物理消毒方法。

(3)化學消毒法：zui常見的是70%酒精及1‰的新潔而滅，前者主要用于操作者的皮膚，操作臺表面及無菌室內的壁面處理。后者則主要用器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒。化學消毒法操作簡單、方便有效。

(4)抗生素消毒：確切應記成抗生素滅菌，主要用于培養用液滅菌或預防培養物污染。

如果已經發生真菌污染，原則上應盡快丟棄，但是如果是比較珍貴的細胞系，可以用抗真菌藥物來嘗試搶救，用一般用量的5～10倍來沖擊治療，24～28h后換常規培養液。但是這種方法一般只是在污染早期才有效!

35.二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎?使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么?

二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前，用EDTA清洗細胞，以消除來自培養基中所有的二價離子。

44. 培養基中添加了血清和抗生素后，可長期保存嗎?

一旦您在新鮮培養基中添加了血清和抗生素時，您應該在兩到三周內使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。

45.培養基及其它添加物和試劑可反復凍融嗎?

大部分添加物和試劑zui多可以凍融3次，如果次數更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。

46.為什么要在溶解的一周內使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液?

胰蛋白酶在4℃就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會變得不穩定。

47.保存血清的方法?

我們建議血清應保存在-5℃至-2O℃。若存放于4℃時，請勿超過一個月。若一次無法用完一瓶，建議無菌分裝血清至恰當的滅菌容器內，再放回冷凍。

48. 如何解凍血清才不會使產品質量受損?

將血清從冷凍箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過程中必須規則地搖晃均勻。

49. 血清解凍后發現有絮狀沉淀物出現，該如何處理?

血清中沉淀物的出現有許多種原因，但zui普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后，也會存在于血清中，亦是造成沉淀物的原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質量。

若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內，以400g稍微離心,上清液即可接著加入培養基內一起過濾。不使用過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因為它可能會阻塞過濾膜。

50. 為什么要熱滅活血清?

加熱可以滅活補體系統。激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細胞和巨噬細胞。在免疫學研究，培養ES細胞、平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。

51. 有必要做熱滅活嗎?

實驗顯示，經過正確處理的熱滅活血清，對大多數的細胞而言是不需要的。經此處理過的血清對細胞的生長只有微小的促進，或完全沒有任何作用，甚至通常因為高溫處理影響了血清的質量，而造成細胞生長速率的降低。而經過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點”，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環境中，又會使此沉淀物更增多，使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。

若非必須，可以不需要做熱處理這一步。不但節省時間，更確保血清的質量!

52. 為什么儲存在冰箱中的胎牛血清會出現沉淀?

有些胎牛血清產品沒有預老化，儲存在2-8℃時，血清中的各種蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應該不會影響血清的質量。推薦在-20℃儲存胎牛血清，避免反復凍融。

53. 如何避免沉淀物的產生?

我們建議您在使用血清的時候，注意下列的操作:

(1)解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫)，若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃至37℃)，非常容易產生沉淀物。

(2)解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發生。

(3)請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩定的成分也會因此受到損害，而影響血清的質量。

(4)血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。

(5)若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30分鐘的原則，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。