細胞培養用液的配制具體步驟與消毒方法2

六．血清的滅活

細胞培養常用的是小牛血清，新買來的血清要在56℃ 水浴中滅火30分鐘后，再經過抽濾方可加入培養基中使用。

七.HEPES溶液

HEPES的化學全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid ）。對細胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長時間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為10-50mmol/L，一般培養液內含20mmol /LHEPES即可達到緩沖能力。

1mol/L HEPE緩沖液配制方法如下：

準確稱取HEPTS 238.3g，加入新鮮三蒸水定容至1L。過濾除菌，分裝后4℃保存。

注意：因為現在市售HEPES為約10g包裝的小瓶，所以可根據實際情況靈活配制，但是要保證培養液內HEPES的終濃度仍然為20m mol/L 。如：稱取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，過濾除菌后可完全（20ml）加入1L培養液中，或者每100ml培養液中加入2ml即可。

八.谷氨酰胺

合成培養基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質，谷氨酰胺缺乏要導致細胞生長不良甚至死亡。在配制各種培養液中都應該補加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩定，4℃下放置1周可分解50%，故應單獨配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培養液。加有谷氨酰胺的培養液在4℃冰箱中儲存2周以上時，應重新加入原來的谷氨酰胺。

一般培養液中谷氨酰胺的含量為1～4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液貯存，用時加入培養液。配制方法為，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分攪拌溶解后，過濾除菌，分裝小瓶，-20℃保存，使用時可向100ml培養液中加入1ml谷氨酰胺溶液。

九.肝素溶液的配制：

含有肝素的培養液可以使內皮細胞純度提高，肝素加入全培養液中最終濃度為50ug/ml。因為現在市售的多為肝素鈉，包裝為約為0.56克/瓶，配制時，可將其溶于100ml三蒸水中，定容，過夜，然后過濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為?? ℃ 。使用時，向100ml培養液中加入1ml（精確可加入0.9ml）即可。

十. Ⅰ型膠原酶：

0.1%Ⅰ型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。注意：因為Ⅰ型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。分裝入10ml小瓶-20℃保存。

十一.明膠溶液：

因為明膠難于過濾，所以配制0.1％明膠溶液必須用無菌的PBS配制。所以制備過程中必須要注意無菌操作。首要的問題是如何無菌準確稱量0.1克（配成100ml溶液）—即解決無菌分裝藥品的問題。其次要注意即使是01.的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過夜放置，然后無菌分裝入50ml小瓶中，4℃保存。

注意事項：

1.配制溶液時必須用新鮮的蒸餾水。

2.安裝蔡式濾器時通常使用孔徑0.45微米 和0.22微米濾膜各一張，放置位置為0.45的位于0.22微米的濾膜上方，并且要特別注意濾膜光面朝上。

3.配制RPMI1640培養基時因為還要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，為了保證培養液PH值最終為7.2，可在配制時調PH至7.4。

經驗總結

1.明膠難溶，就稱好，加pbs，高壓滅菌，就ok了；

2.血清，不用滅活，我養海馬神經元和乳鼠根本不滅活，好的很，但有些細胞如平滑肌需要；

3.雙抗，由于其特殊性，水解，從來不加，只要操作ok，不需要；

4.培養基最重要，尤其對于自己配制的，有時候就是不好，ph和滲透壓問題，一定要解決好。