萜類化合物的色譜法制備分離

萜烯簡稱萜，是一系列萜類化合物的總稱，是分子式為異戊二烯的整數倍的烯烴類化合物。萜烯是一類廣泛存在于植物體內的天然來源碳氫化合物，可從許多植物，特別是針葉樹得到。它是樹脂以及由樹脂而來的松節油的主要成分。根據近年來的研究，除了在植物中大量存在萜類化合物外，在海洋生物體內也提取出了大量的萜類化合物，據統計，很多萜類化合物具有重要的生理活性，是研究天然產物和開發新藥的重要來源。

實驗所用萜類化合物樣品中含有雙順和雙反兩種異構體，通常都是使用兩個異構體的混合物直接入藥，極少將其分離成單體。樣品中含有未知雜質極易污染填料導致正相填料分離效果喪失，填料壽命低，分離成本極高，產生大量固廢。另一方面該樣品對水敏感，流動相建議用水量不超過3%，所以反相填料分離也有局限。經過填料篩選實驗最終確定silica是最合適的填料，方法中涉及樣品預處理，濃縮后再進行制備，過程極為繁瑣，耗時極長，需要一種簡潔快速的制備方式。

本實驗選用天津博納艾杰爾科技多級色譜制備純化系統和硅膠填料，集合預處理、濃縮和制備于一體，可以快速制備萜類化合物樣品中的兩個異構體，方法簡單快速，只需要一次進樣操作即可得到目標物。方法也解決了填料壽命問題。

圖1 實驗流程圖

二.實驗方法

2.1實驗用品

? 乙醇;

? 甲醇;

? 水：超純水;

? 正己烷;

? 液相色譜柱：Promosil C18 (5 μm，100 ?，4.6*250 mm);

? 液相色譜柱：Venusil^? XBP Silica(5 μm，100 ?，4.6*250 mm);

? 液相色譜柱：Venusil^? HILIC(5 μm，100 ?，4.6*250 mm);

? 中壓色譜柱：Claricep FLASH silica(20-45 μm，100 ?，12 g);

? 中壓色譜柱：Claricep FLASH silica(40-60 μm，60 ?，80 g);

? 中壓色譜柱：Claricep FLASH silica(20 μm，100 ?，20 g);

? 液相色譜柱：Venusil^? XBP Silica(5 μm，100 ?，2.1*50 mm);

? 制備儀器：多級色譜純化系統;

?l 分析儀器：LC-10F。

? 中壓儀器：CHEETAH^? MP 200

2.2樣品溶解

樣品為淡黃色液體，取200 μL樣品，加入1 mL乙醇超聲溶解。

2.3實驗步驟

2.3.1多級色譜制備方法

①一級上樣系統

色譜柱：Claricep FLASH silica(40-60 μm，60 ?，80 g);

流 速：40 mL /min;

進樣量：1 mL原樣品;

波 長：205/254 nm;

流動相：正己烷

色譜圖：

圖2 一級色譜上樣系統制備圖

收集將4-5 min流出液。

②二級上樣系統

將上步得到的接收液泵入富集小柱中并通過二級快檢系統檢測直至有峰出現則停止二級上樣系統，此時小柱已富集完成。

色譜柱：Claricep FLASH silica(20 μm，100 ?);

流 速：5 mL /min;

色譜圖：

圖3 二級色譜快檢富集色譜圖

③二級快檢系統

色譜柱：Venusil^? XBP Silica(5 μm，100 ?，2.1*50 mm);

流 速：0.3 mL /min;

波 長：205 nm;

進樣量：10 μL富集小柱柱后流出液;

梯流動相：正己烷

④二級輸液系統

二級上樣結束后，開啟二級輸液系統開始講富集小柱中樣品，洗脫下來泵入三級分離系統中色譜柱中，二級快檢系統檢測圖譜無峰時停止洗脫開啟三級分離系統。

流 速：5 mL /min;

流動相：正己烷：乙醇=9:1

圖4 二級色譜快檢輸液色譜圖

⑤三級分離系統

色譜柱：Claricep FLASH silica(20 μm，100 ?，20 g，四支串聯);

流 速：15 mL /min;

波 長：205/254 nm;

流動相：正己烷

色譜圖：

圖5 三級色譜制備圖

分別收集32 min和34 min兩峰接收液,并使用正相檢測條件檢測純度。

2.3.2制備產品檢測條件

色譜柱：Venusil^? XBP Silica(5 μm，100 ?，4.6*250 mm);

流 速：1 mL /min;

進樣量：20 μL;

波 長：205 nm;

流動相：正己烷

色譜圖：

圖6 32 min餾分檢測色譜圖

圖7 34 min餾分檢測色譜圖

圖8 樣品檢測色譜圖

三.結果與討論

3.1前期方法優化實驗：填料篩選

①色譜柱：Promosil C18(5 μm，100 ?，4.6*250 mm);

流 速：1.0 mL /min;

進樣量：5 μL;

波 長：205 nm;

流動相：水：甲醇=5:95

色譜圖：

圖9 反相分析色譜圖

②色譜柱：Venusil^? XBP Silica(5 μm，100 ?，4.6*250 mm);

流 速：1.0 mL /min;

進樣量：5 μL;

波 長：205 nm;

流動相：正己烷

色譜圖：

圖10 silica分析色譜圖

③色譜柱：Venusil^? HILIC(5 μm，100 ?，4.6*250 mm);

流 速：1.5 mL /min;

進樣量：5 μL;

波 長：205 nm;

流動相：正己烷

色譜圖：

圖11 hilic分析色譜圖

小結：

1)由于樣品對水不穩定，如流動相需要加水不易超過3%，該樣品不適合使用反相填料分離，且在反相上分離度不高。Hilic填料分離度差峰拖尾嚴重，只有silica填料是最適合的填料。

2)考慮成本問題，嘗試使用大粒徑填料分離，并且添加保護柱來延長填料壽命。

3.2前期制備方法優化：中壓制備

色譜柱：Claricep FLASH silica(20-45 μm，100 ?，12 g，三支串聯);

流 速：6 mL /min;

進樣量：200 μL;

波 長：205/280 nm;

流動相：正己烷

色譜圖：

圖12 中壓制備色譜圖

小結：

1)樣品可以使用silica 20-45 μm中壓填料分離異構體。

2)由于樣品中含有雙順和雙反兩種異構體，并含有較大極性的雜質，此雜質在正相條件下無法沖出會吸附在硅膠填料上，在經過多次上樣后會污染硅膠填料，柱效逐漸下降，再結合成本問題，因此采用多級色譜制備方法。

3.3結果

經過填料篩選及中壓制備方法摸索最終確定以silica中壓填料為基質的多級分離方法，可以有效分離該樣品中的兩個異構體。

3.4討論

? 由于樣品中含有強保留雜質會污染silica填料使填料活性喪失，故實驗需要首先過一遍硅膠柱除掉此類雜質(次硅膠柱可重復使用)然后再使用falsh silica柱分離，這樣可以提高flash柱的使用壽命。

? 使用多級色譜簡化了操作過程，縮短單次分離時間，提高效率。

四.結論

實驗結果表明，采用天津博納艾杰爾科技有限公司多級色譜純化系統結合硅膠填料，可以有效快速分離該萜類化合物雙順和雙反異構體的混合物，該方法更有效、更快捷、更準確。