蛋白質中氨基酸外消旋化修飾非特定位點分析方法研究

　　王佳鳳1,2，王生偉3*，李博1,2**，狄斌1,2

　　（中國藥科大學藥學院藥物代謝研究中心，江蘇 南京 210009）

　　*通訊作者：劉李，教授

　　[摘要]

　　近年來研究發現體內維生素 A 類物質（包括視黃醇、視黃醛和視黃酸）在糖尿病的發生發展中起到重要的調節作用，視黃酸是維生素 A 在體內的主要代謝產物，同時也是體內重要的活性物質之一，可以激活視黃酸受體和視黃醇類 X 受體，從而調節體內大量基因的表達，參與多個生理過程，如生殖、免疫和新陳代謝。糖尿病狀態下體內視黃酸濃度紊亂，反之體內視黃酸失衡也會使糖脂代謝紊亂，從而影響糖尿病的進程。對視黃酸在糖脂代謝、胰島素分泌和胰島素抵抗中的作用研究進行綜述，并探討視黃酸與糖尿病之間的關系。

　　維生素 A（視黃醇）是人體所必需的脂溶性維生素，任何動物自身不能合成維生素 A，必須從食物中攝取

　　[1]。維生素 A 能調節生殖、免疫、視覺和新陳代謝，并維持皮膚、肺、骨髓、肝臟和神經系統的正常功能

　　[2-3]。在正常生理條件下，維生素 A 主要存在于肝臟、脂肪和胰腺等組織，體內 80% 的維生素 A 以視黃醇酯的形式儲存在肝臟星型膠質細胞胞質的脂滴內

　　[4]。在體內，維生素 A 首先由視黃醇脫氫酶（retinol dehydrogenase，RDH）和醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）氧化成視黃醛，視黃醛再經由視黃醛脫氫酶（retinal dehydrogenase， RALDH）不可逆氧化成視黃酸，視黃酸是維生素 A 參與生理過程的主要活性物質

　　[5]。視黃酸同時也經細胞色素酶（CYP450 酶）中的 CYP26 家族代謝成非活性的 4-羥基視黃酸等極性代謝物，且視黃酸的分解代謝是維持細胞和組織視黃酸水平的關鍵

　　[6-7]。視黃酸以多種異構體形式存在，體內視黃酸主要有全反式視黃酸（all-trans retinoic acid，atRA）、9-順式視黃酸（9-cis retinoic acid，9-cis RA）、13-順式視黃酸（13-cis retinoic acid，13-cis RA）和 9，13-順式視黃酸（9，13-cis retinoic acid，9，13-cis RA）。其中 atRA 是體內的最主要的異構體形式 [8]。視黃酸主要通過激活視黃酸受體（retinoic acid receptor， RAR）和視黃醇類 X 受體（retinoid X receptor， RXR）來調控基因表達和蛋白的產生，RAR 和RXR 可與其他核受體形成同源或異源二聚體，包括RAR、肝臟 X 受體（liver X receptor，LXR）、過氧化物酶體增殖激活受體（peroxidosome proliferators activate receptors，PPAR）等

　　[9-10]。據報道，視黃酸可調控 500 多種基因，并且參與肥胖、糖尿病、腫瘤、精神類疾病等疾病的過程

　　[11]。

　　除了血糖、血脂和胰島素水平紊亂外，糖尿病患者往往也伴有嚴重的維生素 A 類物質水平失衡。早在 1937 年就有研究人員報道糖尿病患者肝中視黃醇水平顯著升高，近期的臨床研究和動物實驗均顯示糖尿病和肥胖引起體內維生素A 類物質紊亂

　　[12-13]。筆者所在實驗室研究顯示，高脂飼養大鼠和糖尿病大鼠體內維生素 A 類物質水平紊亂，胰腺、肝和腎等組織中視黃醇濃度明顯增加，而血中視黃醇濃度明顯降低，同時還發現高脂飼養大鼠和糖尿病大鼠肝中視黃酸濃度顯著增加，而視黃醛濃度顯著降低， 這種視黃醛和視黃酸濃度改變和肝臟 ADH/RDH 活性與表達降低以及 RALDH 活性與表達增加相對應 [13]。有文獻報道視黃酸和 RXR 激動劑 LG268 可引起大鼠血漿中三酰甘油水平升高

　　[14]。另有文獻報道臨床病人服用視黃酸常伴隨高血脂血癥等副作用

　　[15-16]。RALDH1a1-/ -基因敲除小鼠也表現出較低的空腹血糖和肝糖異生水平，其肝和脂肪等組織中也呈現低濃度的視黃酸和高濃度的視黃醛，且高脂飼料喂養也不易引起 RALDH1a1-/ -小鼠肥胖和胰島素抵抗發生

　　[17]。此外研究還發現，用維生素 A 缺乏飼料喂養大鼠 6 周后，維生素 A 缺乏大鼠血漿中葡萄糖、三酰甘油和胰島素等指標相對于對照組大鼠有明顯降低，且體內脂肪堆積減少，體質量降低

　　[18]。這些結果說明視黃酸濃度紊亂有可能參與糖尿病發生發展。視黃酸對糖尿病進程的影響正成為近期研究的熱點，本綜述將從視黃酸對糖脂代謝、胰島素分泌以及胰島素抵抗的影響及其調節機制等方面展開探討。

　　1

　　外消旋化修飾簡述

　　蛋白質是一種手性分子，其結構由其氨基酸組成和結構所決定。除甘氨酸外，天然存在的氨基酸都具有 2 種手性形式，因而可能形成具有相同氨基酸序列的非對映異構體蛋白。最初，生物學上認為生物體只利用 L-氨基酸來合成蛋白質

　　[1]。20 世紀40 年代起，在微生物體內發現含 D-氨基酸多肽

　　[2]， 其中一些多肽是通過硫酯中間體

　　[3]

　　在多酶復合物上逐步組裝的。在 20 世紀 80 年代， Kreil 等

　　[4]

　　從南美樹蛙的皮膚分泌物中分離出了一種具有生物活性的 D-氨基酸多肽。

　　蛋白質的氨基酸外消旋 化（amino acid racemization，AAR）指蛋白質中至少 1 個氨基酸殘基從 L-氨基酸轉變為 D-氨基酸，這是一種蛋白質翻譯后修飾（post-translational modification，PTM）類型，通常用 D-/L -氨基酸含量比值表示修飾程度

　　[5]。AAR 可能會引起蛋白質分子內氫鍵、高級結構等的變化，從而導致蛋白質的活性、穩定性等物理和生化特征的改變

　　[6-7]。蛋白質的 AAR 修飾研究對疾病生物標志物的探尋、重大疾病發病機制的探索等均具有重要意義。

　　2 外消旋化修飾與疾病相關性

　　生物體內 AAR 修飾速率較慢

　　[8]。在含有代謝穩定的長壽蛋白質的各種人類和動物組織中，能夠發現 AAR 修飾呈年齡依賴性。對不同年齡層次人群的椎間盤彈性蛋白（intervertebral disc，IVD) 中天冬氨酸（Asp）的 AAR 修飾進行分析

　　[9]，結果顯示彈性蛋白中 D-Asp 與 L-Asp 比值隨年齡增長呈升高趨勢，并推測 IVD 中 Asp 的 AAR 修飾可能干擾彈性蛋白、膠原蛋白和蛋白聚糖分子的三級結構和功能，引發椎間盤的組成和結構發生變化，從而導致疾病的發生

　　[10]。人大腦神經纖維蛋白（Tau 蛋白） 的相關研究發現，Tau 蛋白重復結構域中 Asp265

　　發生 AAR 修飾

　　[11]，人大腦中 D-Asp 水平顯著增加可能使維持髓鞘結構和白質正常功能的蛋白失效

　　[12]， 導致大腦功能障礙或阿爾茨海默病（AD）。其他如晶狀體中的 α-、β -晶體蛋白

　　[13-14]

　　也存在年齡依賴性的 AAR 情況。

　　3

　　蛋白質整體外消旋化修飾的分析方法

　　蛋白質整體 AAR 修飾水平一般通過水解后分析 D -與 L-氨基酸的比值來評價。通常提取分離目標蛋白后，采用酸水解法將蛋白質水解成游離氨基酸，然后分析各氨基酸 D -型與 L-型的比值，從而判斷蛋白質中各氨基酸 AAR 修飾水平。

　　常用的分析手段包括液相色譜質譜聯用技術（LC-MS）、毛細管電泳色譜質譜聯用技術（CE-MS）、二維液相色譜質譜聯用技術（2D-LC-MS）及核磁共振（NMR）技術等。LC-MS 法通常使用手性衍生化試劑將酸水解后的 D-/L-氨基酸衍生化，得到互為非對映異構體的衍生產物，在反相柱上分離后進行質譜檢測。常用的手性衍生化試劑包括 2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖異硫氰酸酯（GITC）[15-16]

　　 等，一些新型衍生化試劑如琥珀酰亞胺基 (4S)-(3-[（芐氧基）羰基 ]-5-氧代-1，3-唑烷-4-基 ) 乙酸酯 [(S) -COXA-Osu] 等

　　[17]

　　因具有質譜兼容性好、生物基質影響小等優點而被用于 AAR 修飾的分析。

　　CE-MS 法多數通過在電泳緩沖液中加入手性試劑從而實現 D-/L -氨基酸的分離和 AAR 修飾的測定，常用的手性選擇劑包括環糊精等

　　[18]。同時，有文獻報道可使用異硫氰酸熒光素（FITC）結合毛細管電泳/激光誘導熒光技術（CE/LIF）來對神經肽的AAR 修飾進行檢測

　　[19]。

　　2D-LC-MS 法的優勢在于可減小生物樣本基質干擾，以叔丁基氨甲酰奎寧（tBuCQN）手性柱和奎尼丁（tBuCQD）手性柱為一維和二維的色譜柱，由于這 2 種固定相具有相似的化學選擇性和相反的手性結構，對手性組分呈現反向洗脫順序，使其在一維和二維中的洗脫位置不同，而非手性組分在一維及二維色譜中洗脫位置不變，從而從目標對映體的色譜空間中去除，避免與潛在干擾重疊

　　[20]。

　　NMR 法是通過對含有（R）-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸的樣品溶液進行 1H-NMR 分析，對結果中 1 個或多個質子的光譜不等效性進行比較，有效地實現氨基酸 AAR 修飾的鑒別

　　[21]。

　　上述這些方法可用于蛋白質整體 AAR 修飾水平的鑒定和測定，但一方面受到蛋白質水解、衍生化過程中 L-氨基酸向 D-氨基酸轉化的干擾，另一方面僅能對蛋白質中各氨基酸整體的 AAR 修飾情況進行鑒定，無法確定 AAR 修飾位點，更難以實現蛋白質活性中心等特定位點的AAR 修飾的分析[22]。

　　4 特定位點外消旋化修飾的分析方法

　　特定位點 AAR 修飾分析方法可確定 AAR 修飾位點，通常用于蛋白質中活性中心或功能相關肽段中的 AAR 修飾的定量檢測。常用的分離分析手段包括特異性酶解 LC-MS 法、免疫分析法。

　　蛋白質特異性酶解 LC-MS 法是使用一些具有特異性識別位點的酶對蛋白質進行酶切，得到包含目標氨基酸的肽段，從而可對特定位點氨基酸 AAR 修飾進行定量測定。天冬氨酸 N 端內切酶（Asp-N） 僅識別 L-α-Asp 殘基的 N 端，蛋白異天冬氨酰甲基轉移酶（PIMT）只切割含有 L-β-Asp 的肽段

　　[23]，D-天冬氨酸內切酶（paenidase）[24]

　　只特異性識別 D-α-Asp 殘基的 N 端。現已成功聯合應用這 3 種特異性識別 D-/L-Asp 的商品化酶來鑒別晶狀體中 Asp 的AAR 修飾情況

　　[25]。但此方法由于酶的特異性，可能存在無法識別酶切位點，從而產生假陰性結果，如D-天冬氨酸內切酶無法特異性消化αBT10 肽段（αB -晶體蛋白中第 93 至 103 位的氨基酸序列），推測是由于 D-天冬氨酸內切酶具有序列特異性

　　[25]；此外， 商品化酶的使用成本較高，不適用于大量樣品的檢測分析

　　[26]。

　　酶聯免疫吸附測定法（ELISA）根據其抗體的序列特異性可確定 AAR 位點并進行定量測定。通過酶標記的抗原-抗體反應，通過吸光值檢測可對 D -與 L-Asp 的比值進行檢測，但免疫學測定法需要分析物預選，目前商品化試劑盒種類較少

　　[27]。

　　上述方法的反應條件較溫和，操作中不易產生額外的 AAR 修飾，能對蛋白質活性中心或底物結合位點等功能相關位置的 AAR 修飾情況進行檢測， 無需合成肽段，具有快速、低成本，以及工作量少等優點

　　[25]，可用于探究 AAR 修飾對蛋白質活性的影響。但這些方法大多以蛋白質特定位點或特定氨基酸為靶向，無法分析蛋白質其他位點上的 AAR 修飾情況。

　　4

　　非特定位點外消旋化修飾的分析方法

　　為了更全面地探究體內外 AAR 修飾的規律， 評價蛋白質功能、闡明疾病發病機制，亟需一些普適的非特定位點 AAR 修飾的分析方法，目前可應用于非特定位點 AAR 修飾測定的方法主要包括酶解 LC-MS 法、氨肽酶（aminopeptidase，APM，EC 3.4.11.2）酶解法以及離子淌度質譜法等。

　　5.1

　　 酶解LC-MS 法

　　酶解 LC-MS 法應用于蛋白質中非特定位點氨基酸的 AAR 修飾測定，測定時主要采用胰蛋白酶（trypsin）對目標蛋白質進行酶切，對酶解后的肽段進行選擇性離子監測（SIM）模式掃描分析，分析比較保留時間有差異但具有相同相對分子質量的肽段的色譜峰，同時根據理論酶切位點合成對應的D-/L -標準肽段，通過保留時間來對酶解結果進一步確證，對其進行鑒定及定量分析。

　　Takata 等

　　[28]

　　從人體晶狀體的水溶性部分中分離出βB2 晶體蛋白，用胰蛋白酶消化 βB2 晶體蛋白后， 使用 Proteome Discover 1.0 軟件中的 SEQUEST 算法進行含 Asp 肽的鑒定，然后進行 SIM，與合成得到的理論酶切片段的保留時間相比較來確認 βB2 晶體蛋白中 Asp 的 AAR 位點。結果顯示，人體老化晶狀體的 βB2 晶體蛋白中存在多個 AAR 位點，包括 Asp4、Asp83、Asp92 和 Asp192，同時老年人晶狀體βB2 晶體蛋白中 D -與 L-Asp 的含量比值隨著年齡的增長而增長。

　　該方法采用的酶水解不會引起額外的 AAR 修飾，能夠準確定性及定量測定非特定位點 AAR 修飾情況，方法不需要大量的樣品蛋白質，無需復雜的提取純化過程，能夠從所有活組織和細胞中全面尋找受損或老化蛋白質中的 AAR 修飾位點

　　[29]。但該方法需要合成對應的酶解肽段進行質譜保留時間的確證，合成標準肽段較耗時

　　[30]。

　　5.2

　　 氨肽酶酶解法

　　APM 是一種膜結合外肽酶

　　[31]，可以選擇性地從寡肽、酰胺和芳基酰胺衍生物 N -末端切除 L-氨基酸，主要是堿性和中性氨基酸，其中特別是對亮氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和蛋氨酸等氨基酸具有更高的選擇性和更快的水解速度

　　[32]，大多數L-氨基酸多肽可在 1 ~ 2 h 內被消化。而在 N -末端第2 個氨基酸位置上存在 D-氨基酸或其他蛋白質翻譯后修飾的多肽對 APM 酶解具有抵抗性，這類含 D -氨基酸多肽在數天的時間內都能保持穩定不被水解， 其壽命是 L-氨基酸多肽的 10 倍以上。在研究中較常使用的APM 包括亮氨酸APM、丙氨酸APM [33]

　　等，APM 消化的敏感性與分子大小有關，當底物為小肽時，其酶解更快速且高效

　　[34]。

　　Ewing 等

　　[35]

　　使用 APM 酶解加利福尼亞海兔心臟神經肽，其 L-氨基酸肽段被水解，含 D-氨基酸的肽段被保留，課題組成功鑒別出心臟神經肽中具有AAR 修飾的肽段 NdWFA，通過合成標準肽段對發生 AAR 修飾的肽段進一步定量檢測。該方法降低了中樞神經提取物的復雜性，不需要多肽對照品即可實現生物樣本中蛋白質非特定位點 AAR 修飾鑒定。Livnat 等

　　[36]

　　也使用 APM 酶解法成功鑒別出加利福尼亞海兔神經肽中另一發生氨基酸 AAR 修飾的肽段 GdFFD，同時使用氘代鹽酸對酶解后肽段進行酸水解、用 Marfey 試劑標記以及液相色譜  -質譜法來驗證 D-氨基酸的存在，確定發生 AAR 修飾的氨基酸種類，并對 D-氨基酸進行定量檢測。對加利福尼亞海兔腹腔神經元中另一已知含 D-氨基酸多肽的檢測結果也驗證了該方法的可行性，證明其對篩選潛在的含 D-氨基酸多肽有效。

　　APM 酶解法能夠成功鑒別蛋白質中非特定位點AAR 修飾，其特殊的酶解選擇性可降低生物樣本檢測的復雜性，但也存在一定局限性，特定的 N -末端殘基會增加對 APM 酶解的抵抗力，例如，在 N -末端帶有脯氨酸、谷氨酸的多肽可以抵抗 APM 消化

　　[35]， 使這些多肽在較長一段時間內保持穩定，呈現假陽性結果。同時，當 AAR 修飾發生在肽段中間附近， 或發生在 C -末端附近，則 APM 在酶解過程可能會忽略這個位點

　　[37]，從而導致假陰性結果，在這種情況下，可以對羧肽酶進行研究，看其是否具備與APM 類似的選擇性酶切 D-氨基酸的特性，為更全面研究 AAR 修飾規律提供基礎

　　[36]。

　　5.3

　　 離子淌度質譜法

　　離子淌度質譜（ion mobility mass spectrometry， IM-MS）是離子淌度光譜與質譜聯用的一種新型質譜分析技術，其靈敏度高、檢測限低并具有實時檢測能力

　　[38]。離子淌度質譜分離原理主要是基于離子的大小和形狀的差異，離子受電場力作用向前運動， 但不同離子在飄移管中與緩沖氣體碰撞的截面不同， 產生不同的阻力從而使其穿過漂移管所需的漂移時間存在差異

　　[39]。較為常用的離子淌度質譜有漂移時間離子遷移質譜（DTIMS）、行波離子遷移質譜（TWIMS）及場不對稱波形離子遷移質譜（FAIMS）[40]這 3 種。目前所使用的 IM-MS 具備基質輔助激光解吸電離離子源（MALDI）或電噴霧離子源（ESI） 等離子源，或四級桿質譜和離子阱質譜等質量分析器串聯使用，從而提高檢測的分辨率和靈敏度[41]。

　　在對含 D-/L-氨基酸的多肽進行 IM-MS 分析時， 由于構型不同，離子穿過漂移管時有先后順序[42]，D-/L -肽段的 b/y 系列各碎片離子的檢出是 IM-MS 法鑒定外消旋化修飾位點的前提。碰撞誘導解離（CID） 技術系使母離子與高壓高能惰性氣體（如 He、N2 等） 發生反復碰撞，使分子積聚能量，當達到一定能量閾值，化學鍵發生斷裂從而產生產物離子，但受肽段濃度、鏈長等因素的影響，其能提供的肽鏈信息有限

　　[43]，特別是肽段帶有多電荷且肽鏈較長時序列組成較難分析，導致 IM-MS 難以鑒定 AAR 修飾位點。利用電子轉移裂解（ETD）技術

　　[44]，將電子轉移至質子化的肽段，可得到更全面的系列碎片離子并增強碎片響應（S/N），便于后續 IM-MS 測定， 其裂解方式可以提供蛋白質翻譯后修飾的重要序列信息，從而大幅度提高 AAR 修飾檢測的覆蓋度和靈敏度，因此在蛋白質組學、復雜化合物以及 AAR 分析方面顯示出特有的優勢，逐漸在分析方面占據重要地位

　　[45-46]。

　　Dwivedi 等

　　[47]

　　采用漂移時間離子遷移質譜法（DTIM-MS），以(S)-(+)-2-丁醇為漂移氣體改進劑， 不同離子在漂移室中經電場力作用，與漂移室中的中性氣體發生碰撞，各離子因結構不同，受到的前進阻力也有差異，因此穿過漂移室的時間也各不相同，從而得以分離。該方法成功分離了包括絲氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和色氨酸等在內的多種物質。Yu 等

　　[48]

　　采用離子淌度遷移質譜法研究了一些常見手性氨基酸，成功分離了色氨酸、脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸及組氨酸，該方法對含芳香環、長鏈以及活性側鏈的氨基酸有顯著的手性分離能力，峰間分辨率高達 1.826 [49]。

　　Jeanne Dit Fouque 等

　　[50]

　　使用行波離子遷移質譜法（TWIM-MS），其分離室中配備多個環形電極， 相鄰電極上的電壓方向相反，從而形成如波浪般的電場壓力，不同離子在電場中的行進速度不同，通過改變行波電場的移動速度可以很好地分離皮啡肽1-4、啡肽Ⅰ、生長激素抑制素-14、γ-黑素細胞刺激素（γ-MSH）等 D-氨基酸多肽。對于具有多電荷的大分子多肽，選擇監測 [M+2H]2+ 或 [M+3H]3+ 離子能有更好的效果。我們已經證明了該方法可以檢測到定量限小于 0.25% 的 AAR 多肽，比文獻報道的其他 LC-MS/MS 方法更好。分解 AAR 多肽的碎裂模式可以識別具有多電荷的大分子多肽并進一步降低檢測限和定量限，由于自由基驅動的 MS/MS 過程比碰撞誘導的解離提供更好的 AAR 修飾識別， TWIM-ETD/ECD-MS 技術將推動生物體中 AAR 修飾分析的發展。Jia 等

　　[51]

　　采用 TWIM-MS 法準確測定了肽段中的 D-氨基酸的 AAR 位點，并將該方法應用于高血糖激素中 D-苯丙氨酸的 AAR 檢測。

　　離子淌度質譜法可以檢測常規質譜法不能區分的復雜化合物或外消旋體等，同時與色譜分離方法相比，所需分析時間短，且該方法的樣品前處理步驟少，簡單易行，提高了 AAR 修飾鑒定的效率，具有其獨特的優勢

　　[52]，但 D-/L-氨基酸肽段的 IM-MS 結果差異較小，生物樣品中的 AAR 修飾檢測容易出現假陽性、假陰性的情況

　　[53]。

　　6 結語

　　隨著科學技術不斷發展，蛋白質中非特定位點氨基酸 AAR 的研究已愈發多樣化，如何提高生物樣本非特定位點 AAR 修飾檢測的準確率，減少檢測結果的假陽性及假陰性情況，同時提高定量分析的重現性，是非特定位點 AAR 修飾研究亟待解決的問題。建立更多高效簡便的非特定位點氨基酸 AAR 位點鑒別及定量檢測的評價方法，有助于更全面地研究體內外 AAR 修飾對蛋白質生理功能的影響， 也對闡明蛋白質 AAR 與重大疾病間的關系具有重要意義。