調節性T細胞（Treg）及其流式檢測方法

Treg細胞概述
高效免疫抑制劑的發現及其聯合應用使臨床器官移植的急性排斥反應大大降低，移植物的存活時間明顯延長；器官移植成為挽救終末期器官功能衰竭患者生命的重要有效途徑。但是免疫抑制劑具有明顯的毒副作用(如對重要臟器的損傷、降低抗腫瘤及抗感染免疫力等)及對治療慢性排斥反應效果較差等問題，均限制了免疫抑制劑的長期應用。因此，相關生命科學工作者嘗試通過誘導移植免疫耐受途徑來避免免疫抑制劑的長期應用及克服移植免疫排斥反應。
在上個世紀九十年代中期，由Sakaguchi等首先證實了天然CD4 CD25 調節性T細胞(regulatory T cell，Treg)為一類具有免疫抑制作用的T細胞，約占外周CD4+T細胞的5～10%。該類細胞以“主動”的方式參與免疫應答／免疫耐受的調控，不僅參與自身免疫耐受調節，而且在腫瘤免疫和移植免疫中也具有重要的作用。

2、Treg細胞的來源
研究證實，天然的CD4 +CD25+Treg細胞來源于胸腺，小鼠出生后第3天切除胸腺，外周缺乏CD4+ CD25+Treg細胞，產生抗自身抗體并出現自身免疫性胃炎等自身免疫性疾病。而在第0天和第7天切除胸腺，并不表現自身免疫性疾病。這說明出生3d內 是胸腺產生CD4+CD25+Treg細胞的關鍵時期，這時切除胸腺引起自身反應性CD4+T細胞的過度增殖。但是，出生第0天胸腺產生的自身反應性 CD4+T細胞不足，出生第7天胸腺已經產生了足夠的CD4+CD25+Treg細胞，所以這時切除胸腺， 小鼠不出現自身免疫性疾病。Papiernik等證實，CD4+CD25+Treg細胞產生于胸腺，然后遷移到外周發揮作用，CD4+CD25 胸腺細胞與外周的CD4+CD25+Treg細胞一樣，表現對經由TCR的抗原刺激呈低反應性，并且顯示抑制其他T 細胞增殖的能力。CD4+CD25+ Treg細胞的產生需要TCR與胸腺皮質上皮細胞的MHC II類分子間的高親和力作用，MHC II類分子缺陷的小鼠缺乏CD4+CD25+Treg細胞。CD4+CD25+T細胞除了在胸腺產生以外，還可以在未成熟的樹突狀細胞、IL-10、IFN-a、TGF-beta或者低劑量抗原誘導下由外周CD4+CD25-細胞轉變而來，該類細胞稱為誘導的CD4+CD25+Treg細胞。

3、Treg細胞的常用的分子標記
①CD25：Treg細胞調節機體免疫系統平衡，增加免疫耐受。研究表明，多種T細胞分子抗原參與Treg細胞的特異性功能效應。傳統鑒定Treg細胞主要是通過CD4和CD25來標記。但隨著研究的進一步深入，發覺只通過CD4+CD25+雙陽性來定義的Treg細胞并不完全準確
②FOXP3： FOX(forkhead box)是脊椎動物叉頭樣轉錄因子的總稱，是一個具有多種功能的轉錄因子大家族，通常和細胞生長發育的調控有關。FOX 家族成員都有一個叉頭樣結構域，能與DNA結合。FOXP3是叉頭樣轉錄因子家族中的成員，2001年由Brunkow等首次報道。研究發現，它的表達及 功能與調節性T細胞(regulatory T cells，TR細胞)密切相關。如果FOXP3基因發生突變，將影響TR細胞的發育成熟，導致IPEX綜合征(immune dysregulation，polyendocrinop -athy，enteropathy，X linked syndrome)。
FOXP3主要表達于胸腺、脾臟和淋巴結等淋巴器官和組織。在小鼠特異性表達于CD4+CD25+T細胞，而不表達于CD8+T細胞。在人類FOXP3不僅可表達于CD4+CD25+T細胞，還可表達于CD8+CD28-T細胞。但在CD4+T細胞中的表達明顯高于CD8+T細胞。目前，Foxp3(forkhead box P3，Scurfin)是目前公認的Treg細胞的最敏感的標志。
③CD127：最近發現通過表達CD4， CD25和傳導信號FoxP3來定義調節性T細胞時，在一類特殊的細胞群體時會出現問題。我們發現IL-7受體（CD127）在外周血CD4+T的一個亞群中會下調表達。我們證實這些細胞FoxP3陽性，且這群細胞包括那些CD25弱陽性或陰性群體。聯合使用CD4，CD25和CD127可得到高純度的調節性T細胞，比以前的通過其他標志物來區分方法顯著提高。這些細胞在功能抑制實驗中可發揮高度抑制功能。實際上，通過CD4和CD127表達來區分的細胞 數量（包括CD25+CD4+和CD25-CD4+）三倍于通過CD4+CD25hi區分的調節性T細胞亞群。最后，我們使用CD127定量檢測I型糖尿 病病人調節性T細胞，發現CD127可作為人調節性T細胞的標志物。
4、FOXP3流式檢測方法
美國eBioscience公司是最早擁有FOXP3流式檢測抗體的公司之一，公司通過不斷改進和優化，建立了一套完美的針對FOXP3流式檢測特殊的試劑和方案。
（1） 實驗材料
實驗設備
1) 流式上樣管
2) 混勻振蕩器
3) 離心機
4) 移液器、Tips
5) 流式細胞儀
所需試劑
1) 細胞表面染色的熒光標記的單抗試劑（CD4、CD25或CD8等）
2) FOXP3熒光標記抗體
3) 溶血素：（eBioscience目錄號00-4333）用于裂解紅細胞
淋巴細胞分離液：若樣品為人的全血，建議先用分離液分離出單個核細胞后再做后續檢測
5) 固定劑和破膜劑：（eBioscience FOXP3檢測專用試劑，目錄號為00-5521或00-5523；在FOXP3染色前，將其中的Fixation/Perme -abilization Concentrate和Fixation/Permeabilization Diluent以1：3的比例混合，配制好的溶液保存時間不要超過一天）
6) 其他試劑：Flow Cytometry Staining Buffer（00-4222）或PBS，Permeabil -ization Buffer（Cat.No 00-8333）等
（2） 實驗操作步驟
注：對于不同的FOXP3克隆號抗體，在操作上可能存在著一些細微的差別。具體實驗時，請參考相應的抗體說明書上的操作步驟。此操作以人Foxp3 (clone PCH101, cat. XX-4776).為例。
1) 在每個流式上樣管中加入100ul準備好的細胞懸液，細胞數約為1x106個。
2) 按照細胞表面抗原染色方法標記表面抗原（如CD4、CD8、CD25等）。
3) 用預冷的Flow Cytometry Staining Buffer或預冷的PBS洗滌細胞。
4) 旋渦震蕩重懸細胞后加入1ml的固定/破膜工作液（Fixation/Permeabilization），并再次旋渦混勻。
5) 避光4℃孵育30-60分鐘。
6) 加入2ml Permeabilization Buffer（Cat.No 00-8333）工作液離心洗滌細胞并棄去上清液。
7) 重復第5步操作洗滌細胞。
8) [可選]加入稀釋好的2%（2ul）的正常大鼠血清（用Permeabilization Buffer工作液進行稀釋）100ul，在避光4℃孵育15分鐘
9) 封閉液無需洗去，直接加入稀釋好的熒光標記FOXP3抗體（用Permeabilization Buffer工作液進行稀釋）20ul，避光4℃孵育至少30分鐘。建議進行預實驗摸索出抗體的最適濃度。
10) 加入2ml Permeabilization Buffer（Cat.No 00-8333）工作液離心洗滌細胞并棄去上清液。
11) 重復上一步洗滌細胞。
12) 用適量體積的Flow Cytometry Staining Buffer重懸細胞，并上機檢測并分析。注：由于染色過程中使用了細胞固定和破膜，對比起活細胞在形態上會有一定變化，因此FSC/SSC圖中圈門時需要做一定調整。