金納米顆粒有望讓基于CRISPR的基因療法治療HIV感染

在一項新的研究中，來自美國弗雷德哈欽森癌癥研究中心的研究人員通過簡化將基因編輯指令遞送給細胞的方式，朝著讓基因療法變得更加實用的方向邁出了一步。通過使用金納米顆粒替換滅活病毒，他們安全地在HIV和遺傳性血液疾病的實驗室模型中遞送基因編輯工具。相關研究結果近期發表在Nature Materials期刊上，論文標題為“Targeted homology-directed repair in blood stem and progenitor cells with CRISPR nanoformulations”。

圖片來自the Adair lab at Fred Hutch。

這是第一次使用裝載CRISPR的金納米顆粒來編輯稀有但功能強大的造血干細胞亞群中的基因，其中造血干細胞是體內所有血細胞的來源。這些攜帶CRISPR的金納米顆粒成功地對造血干細胞中的基因進行編輯，而且沒有毒副作用。

論文通訊作者、弗雷德哈欽森癌癥研究中心臨床研究部助理成員Jennifer Adair博士說，“隨著基因療法在臨床試驗中取得成功并為患者所用，我們需要一種更實用的方法。我想找到一種更簡單的方法，一種可以被動地將基因編輯工具遞送給造血干細胞的方法。”她補充道，世界上有數百萬人無法使用目前的基因治療方法。

雖然人們能夠更快地和更容易地讓CRISPR對基因組進行基因修飾，但是它仍然存在挑戰。讓細胞接受CRISPR基因編輯工具涉及施加較小的電擊，這能夠破壞甚至殺死細胞。如果需要精確的基因編輯，那么必須設計額外的分子來遞送它們，這又會增加成本和時間。

金納米顆粒是一種很有前途的替代品，這些因為這些微小球體（大約是食鹽粒度的十億分之一）的表面允許其他分子容易地粘附在它們上并保持粘附。

論文第一作者、弗雷德哈欽森癌癥研究中心博士后研究員Reza Shahbazi博士說，“我們設計了金納米顆粒，它們能夠快速地跨過細胞膜，避開試圖破壞它們的細胞器，并直接進入細胞核中進行基因編輯。”7年來，他一直在研究用于藥物和基因遞送的金納米顆粒。

Shahbazi利用純化的以液體形式裝在一個小實驗室瓶子里的實驗室級金制成金納米顆粒。他將純化的金與導致單個金離子形成微小顆粒的溶液混合在一起，隨后他們測量所形成的顆粒的尺寸。他們發現特定尺寸---19納米寬---是最好的，這是因為它足夠大、足夠粘，能夠將基因編輯工具添加到這些顆粒的表面上，同時又足夠小，可以被細胞吸收。

通過包裹在這些金納米顆粒上，Adair及其團隊添加了下面的基因編輯組分：
（1）一種稱為crRNA的分子向導，起著遺傳GPS（全球定位系統）的作用，可將CRISPR復合物引導到基因組中遭受切割的位點上。
（2）CRISPR核酸酶蛋白，通常被稱為“基因剪刀”，可以切割DNA。最常用的CRISPR核酸酶蛋白是Cas9。但是，Adair團隊還研究了Cas12a（以前稱為Cpf1），這是因為Cas12a在DNA中進行交錯切割。他們希望這可以讓細胞更有效地修復切割，同時將新的遺傳指令嵌入細胞中。Cas12a優于Cas9的另一個優點是它僅需要一個分子向導，鑒于金納米顆粒的空間限制，這一點是很重要的。Cas9需要兩個分子向導。
（3）有關進行基因變化的指令（“ssDNA”）。 Adair團隊選擇了兩種免受疾病的遺傳性基因變化：CCR5可阻止HIV感染，γ血紅蛋白可阻止鐮狀細胞病和地中海貧血等血液疾病。
（4）聚乙烯亞胺涂層聚集在這些金納米顆粒的表面上，使得它們攜帶更多的正電荷，這能夠讓它們更容易被細胞吸收。這是對讓細胞攝取基因編輯工具的另一種稱為電穿孔的方法進行改進。在電穿孔中，給細胞施加較小的電擊，讓這些細胞接受外來的遺傳指令的進入。

這些研究人員隨后分離出細胞表面上攜帶著蛋白標志物CD34的造血干細胞。這些CD34陽性造血干細胞含有產生整個血液和免疫系統的造血祖細胞。

Adair說，“這些細胞每天補充體內的血液，使得它們成為一次性基因治療的良好候選者，這是因為它們能夠自我更新，在一生當中持續存在。” 

通過在實驗室培養皿中觀察人造血干細胞，這些研究人員發現他們的裝載著基因編輯工具的金納米顆粒在加入后6小時內被細胞自然攝取，并且在24到48小時內能夠看到基因編輯發生。他們觀察到相比于更常用的Cas9 CRISPR蛋白伴侶，Cas12a CRISPR蛋白伴侶更好地對細胞進行基因編輯。

在這些研究人員將這些經過基因編輯的細胞注射到小鼠模型體內8周后，基因編輯效應達到頂峰；注射22周后，這些經過基因編輯的細胞仍然存在。他們還在這些小鼠模型的骨髓、脾臟和胸腺中發現了這些經過基因編輯的細胞，這表明這些器官中發生細胞分裂的血細胞能夠發揮治療作用，無需再對這些小鼠進行治療。

Adair說，“我們相信我們有兩種良好的候選疾病---HIV感染和血紅蛋白病---雖然我們也正在評估其他的疾病---以及如何產生更大的遺傳變化，在這些疾病中，較小的遺傳變化能夠產生重大影響。下一步是增加基因編輯在每個細胞中發生的程度，這絕對是可行的。這將讓它更接近成為一種有效的治療方法。” 

在這項新的研究中，這些研究人員報道10％到20％的造血干細胞發生了基因編輯，這是一個很有希望的開端，但是他們的目標是50%或以上的細胞發生基因編輯，他們相信這將有很大的機會對抗這些疾病。

參考資料：

Reza Shahbazi et al. Targeted homology-directed repair in blood stem and progenitor cells with CRISPR nanoformulations. Nature Materials, 2019, doi:10.1038/s41563-019-0385-5.