間接ELISA法

實驗概要

Enzyme  linked immunosorbent  assay，ELISA。指將可溶性的抗原或抗體吸附到聚苯乙烯等固相載體上，進行免疫反應的定性和定量方法。1971年瑞典學者Engvail和Perlmann,荷蘭學者Van  Weerman和Schuurs分別報道將免疫技術發展為檢測體液中微量物質的固相免疫測定方法，即酶聯免疫吸附測定法 (enzyme-linked  immunosorbent assay , ELISA) 。ELISA現在已成為目前分析化學領域中的前沿課題  ，它是一種特殊的試劑分析方法，是在免疫酶技術( immunoenzymatic techniques )  的基礎上發展起來的一種新型的免疫測定技術 。

主要試劑

碳酸氫鹽/碳酸鹽包被緩沖液 (100 mM)

PBS

封閉液

洗滌液

抗體稀釋緩沖液 

實驗步驟

1.   包被抗原

1)   用 PBS 或碳酸鹽緩沖液稀釋抗原至終濃度 20 μg/ml。吸取 50 μl 稀釋抗原到 PVC 酶標板上的第一排孔，按要求往后進行系列稀釋。

2)   酶標板上覆蓋封口膜，室溫孵育 2 小時，或者 4 °C 過夜。孵育時間需要優化。

3)   倒掉包被液，用 PBS 洗板 3 次，每孔 200 μl。在水池上輕甩倒掉洗液，在紙巾上輕拍酶標板除去殘留液體。

2.   封閉

1)   用含 5% 脫脂奶粉或含 5% 血清的 PBS 緩沖液封閉酶標板上剩余的蛋白結合位點，每孔加 200 μl。也可用其他封閉劑如 block ACE、BSA（牛血清蛋白）代替。

2)   封口膜覆蓋酶標板室溫至少孵育 2 小時，或者 4 °C 過夜。

3)   PBS 洗板 2 次。

3.   加一抗和二抗進行孵育

1)   每孔加入 100 μl 稀釋好的一抗。

2)   封口膜覆蓋酶標板室溫孵育 2 小時，孵育時間需要進行優化。通常 2 小時孵育即可獲得足夠強的信號，但如果獲得的信號較弱時，可4 °C 孵育過夜獲得較強信號。

3)   PBS 洗板 4 次。

4)   加標記二抗，每孔 100 μl。稀釋到最佳濃度（參照說明書），使用前用封閉液現配。

5)   封口膜覆蓋酶標板室溫孵育 1-2 小時。

6)   PBS 洗板 4 次。

4.   檢測

1)   用多通道吸液器向每孔加入 100 μl（或 50 μl）底物。

2)   顯示出足夠深的顏色后，加終止液每孔 100 μl（如有必要）。

3)   酶標儀讀取吸光度值（光密度）。