霉菌的形態觀察（實驗）

霉菌菌絲比較粗大（菌絲和孢子的直徑達到3-10μm），通常是細菌菌體寬度的幾倍至幾十倍，因而可用低倍、高倍鏡觀察。霉菌菌絲細胞容易收縮變形，孢子容易飛揚，在制備霉菌標本時，常用乳酸石炭酸溶液作為介質，具有不使細胞變形，可殺菌防腐，不易干燥，能保持較長時間等優點。

一、實驗目的
1. 學習并掌握觀察霉菌形態的基本方法；
2. 了解常見霉菌（根霉、毛霉、曲霉、青霉、紅曲霉、白地霉）的基本形態特征。

二、實驗材料
1. 菌種：根霉（Rhizopus sp.）、毛霉（Mucor sp.）、曲霉（Aspergillus sp.）、青霉（Penicillium sp.）、紅曲霉（Monascus sp.）的平板培養物，白地霉（Geotrichum candidum）搖瓶培養液。
2. 培養基：土豆瓊脂培養基（PDA）或察氏培養基。
3. 溶液或試劑：乳酸石炭酸棉藍染色液。
4. 其他：無菌吸管，平皿，載玻片，蓋玻片，解剖針，顯微鏡等。

三、實驗原理
霉菌菌絲比較粗大（菌絲和孢子的直徑達到3-10μm），通常是細菌菌體寬度的幾倍至幾十倍，因而可用低倍、高倍鏡觀察。霉菌菌絲細胞容易收縮變形，孢子容易飛揚，在制備霉菌標本時，常用乳酸石炭酸溶液作為介質，具有不使細胞變形，可殺菌防腐，不易干燥，能保持較長時間等優點。若加入棉藍，又具有一定的染色效果。
霉菌的有些結構在制片過程中易被破壞，影響觀察，可采用載片培養法。此法便于直接在顯微鏡下觀察，尤其適用于根霉的假根、曲霉的足細胞及分生孢子鏈等結構的著生和生長情況的觀察。并且還可以在同一標本上觀察到微生物發育的不同階段的形態。

四、操作步驟
（一）一般觀察法：
1. 點種培養：用接種針沾取斜面少許孢子在無菌的察氏培養基中央穿刺接種（倒置培養皿穿刺接種），30℃下培養7-10天，形成巨大菌落培養物。
2. 直接制片：在載玻片中央加一滴乳酸石炭酸棉藍染色液于潔凈，打開霉菌平板培養物，用解剖針從菌落的邊緣挑取少量帶有孢子的菌絲，放入載玻片的染液中，細心地把菌絲挑散開，加蓋玻片，注意不要產生氣泡，置于顯微鏡下觀察，菌絲呈蘭色，顏色的深度隨菌齡的增加而減弱。
觀察根霉時，注意觀察其菌絲有無橫隔、假根、孢子囊柄、孢子囊、囊軸、囊托、孢子囊孢子及厚垣孢子。
觀察毛霉時，注意觀察其菌絲無橫隔、孢子囊柄、囊軸、孢子囊孢子及后垣孢子。
觀察曲霉時，注意觀察其菌絲有橫隔、足細胞、分生孢子梗、頂囊、小梗（形狀、層數及著生情況）、分生孢子。
觀察青霉時，注意觀察其菌絲有橫隔、分生孢子梗、帚狀枝（小梗的輪數及對稱性）、分生孢子。
觀察紅曲霉時，注意觀察其菌絲有橫隔、分生孢子著生情況、閉囊殼、子囊孢子。
（二）載玻片濕室培養觀察法
也稱載片培養法，用無菌操作將培養基瓊脂薄層置于載玻片上，接種后蓋上蓋玻片培養，霉菌即在載玻片和蓋玻片之間的有限空間內沿蓋玻片橫向生長。培養一定時間后，將載玻片上的培養物置于顯微鏡下觀察。載片培養法制備的標本片可直接在顯微鏡下觀察，這種培養觀察方法保持了霉菌的自然生長狀態，尤其適用于根霉的假根、匍匐菌絲，曲霉的足細胞的觀察，并且還可在同一標本片上觀察霉菌的不同生長階段的形態。
載玻片濕室培養觀察法具體操作：
1. 準備濕室：在培養皿底部鋪一張圓形濾紙片，濾紙片上依次放上“U”形載玻片擱架、載玻片、蓋玻片（兩片），蓋上皿蓋，外用紙包扎，高壓滅菌（9.8×104Pa）20分鐘后，60℃烘箱干燥，備用。
2. 取菌接種：用接種環挑取少量待觀察的霉菌孢子，置于濕室的載玻片上，每張載玻片可接同一菌種的孢子兩處。接種時只要將帶菌的接種環在載玻片上輕輕碰幾下即可。
（接種量要少，以免培養后菌絲過于稠密而影響觀察）
3. 加培養基：用無菌細口滴管吸取少許融化并冷卻至45℃的培養基，滴加到載玻片的接種處，培養基應滴得圓而薄，直徑約為0.5cm（滴加量一般以1/2小滴為宜），注意無菌操作。
4. 加蓋玻片：在培養基未徹底凝固前，用無菌鑷子將皿內的蓋玻片蓋在瓊脂薄層上，用鑷子輕壓蓋玻片，使蓋玻片和載玻片之間的距離相當接近，但不能壓扁。
（蓋玻片不能緊貼載玻片，要彼此留有小縫隙，一是為了通氣，二是使各部分結構平行排列，易于觀察。）
5. 倒保濕劑：每皿倒入約3mL 20%的無菌甘油，使皿內濾紙完全濕潤，以保持皿內濕度，蓋上皿蓋。制成載玻片濕室，28℃培養。
觀察：將培養好的載玻片取出，置于顯微鏡下直接觀察。