飼料粗蛋白測定的測定方法

實驗概要

Method for the determination of crude protein in feedstuffs

本標準參照采用ISO5983-1979《動物飼料-氮含量的測定和粗蛋白含量計算》。

1  主題內容與適用范圍

本標準規定了飼料中粗蛋白含量的測定方法。

本標準適用于配合飼料、濃縮飼料和單一飼料。

實驗原理

凱氏法測定試樣中的含氮量，即在催化劑作用下，用硫酸破壞有機物，使含氮物轉化成硫酸銨。加入強堿進行蒸餾使氨逸出，用硼酸吸收液吸收后，再用酸滴定。測出氮含量，將結果乘以換算系數6.25，計算出粗蛋白的含量。

主要試劑

4  試劑

4.1硫酸（GB625）:化學純，含量為98%，無氮。

4.2混合催化劑

0.4g 硫酸銅，5個結晶水（GB665）， 6g 硫酸鉀（HG3-920）或硫酸鈉（HG3-908），均為化學純，磨碎混勻。

4.3 氫氧化鈉（GB629）：化學純，40%水溶液（M/V）。

4.4硼酸（GB628），化學純，2%水溶液（M/V）。

4.5混合指示劑溶液

甲基紅（HG3-958）0.1%乙醇溶液，溴甲酚綠（HG3-1220）0.5%乙醇溶液，兩溶液等體積混合，在陰涼處保存期為三個月。

4.6鹽酸標準溶液，c(HCl)=0.1mol/L、0.02mol/L

配制如下：

移取8.3mL 鹽酸(分析純)，于1000mL 容量瓶中，用水稀釋至刻度，混勻。此溶液為c(HCl)=0.1mol/L。

移取1.67mL 鹽酸(分析純)，于1000mL 容量瓶中，用水稀釋至刻度，混勻。此溶液為c(HCl)=0.02mol/L。

4.7蔗糖，分析純。

4.8硫酸銨，分析純，干燥。

4.9硼酸吸收液

1%硼酸水溶液1000mL，加入0.1%溴甲酚綠乙醇溶液10mL， 0.1% 甲基紅乙醇溶液7mL， 4%氫氧化鈉水溶液0.5mL，混合，置陰涼處保存期為一個月(全自動程序用)。

主要設備

5儀器設備

5.1實驗室用樣品粉碎機或研缽；

5.2分樣篩，孔徑0.45mm(40 目) ；

5.3 分析天平，感量0.0001g；

5.4消煮爐或電爐；

5.5 滴定管，酸式，10、25mL ；

5.6凱氏燒瓶，250mL ；

5.7 凱氏蒸餾裝置，常量直接蒸餾式或半微量水蒸氣蒸餾式；

5.8錐形瓶，150、250mL ；

5.9 容量瓶，100mL ；

5.10 消煮管，250mL ；

5.11定氮儀，以凱氏原理制造的各類型半自動，全自動蛋白質測定儀。

實驗材料

6 試樣的選取和制備

選取具有代表性的試樣用四分法縮減至200g，粉碎后全部通過0.45mm（40 目篩），裝于密封容器中， 防止試樣成分的變化。

實驗步驟

7  分析步驟

7.1 仲裁法

7.1.1試樣的消煮

稱取試料0.5～1g(含氮量5～80mg)準確至0.0002g，放入凱氏燒瓶（5.6）中，加入6.4g混合催化劑（4.2），與試樣混合均勻，再加入12mL  硫酸（4.1）和2  粒玻璃珠，將凱氏燒瓶（5.6）置于電爐上加熱，開始小火，待樣品焦化，泡沫消失后，再加強火力(360～410℃)直至呈透明的藍綠色，然后再繼續加熱，至少2h。

7.1.2氨的蒸餾

7.1.2.1 常量蒸餾法

將試料消煮液（7.1.1）冷卻，加入60～100mL  蒸餾水，搖勻，冷卻。將蒸餾裝置（5.7）的冷凝管末端浸入裝有25mL 硼酸吸收液和2  滴混合指示劑（4.5）的錐形瓶內。然后小心地向凱氏燒瓶中加入50mL  氫氧化鈉溶液（4.3），輕輕搖動凱氏燒瓶（5.6），使液溶混勻后再加熱蒸餾，直至流出液體積為100mL。降下錐形瓶，使冷凝管末端離開液面，繼續蒸餾1～2min，并用蒸餾水沖洗冷凝管末端，洗液均需流入錐形瓶內，  然后停止蒸餾。

7.1.2.2 半微量蒸餾法

將試樣消煮液（7.1.1）冷卻，加入20mL  蒸餾水，轉入100mL 容量瓶中，冷卻后用水稀釋至刻度，搖勻，做為試樣分解液。將半微量蒸餾裝置（5.7）的冷凝管末端浸入裝有20mL  硼酸吸收液和2 滴混合指示劑（4.5）的錐形瓶內。蒸汽發生器（5.7）的水中應加入甲基紅指示劑數滴，硫酸數滴，在蒸餾過程中保持此液為橙紅色，  否則需補加硫酸。準確移取試樣分解液10～20mL注入蒸餾裝置（5.7）的反應室中，用少量蒸餾水沖洗進樣入口，塞好入口玻璃塞，再加10mL  氫氧化鈉溶液（4.3），小心提起玻璃塞使之流入反應室，將玻璃塞塞好，且在入口處加水密封，防止漏氣。蒸餾4min，降下錐形瓶（5.8），使冷凝管末端離開吸收液面，再蒸餾1min，用蒸餾水沖洗冷凝管末端，洗液均流入錐形瓶內，然后停止蒸餾。

注：7.1.2.1 和7.1.2.2 蒸餾法測定結果相近，可任選一種。

7.1.2.3 蒸餾步驟的檢驗

準確稱取0.2g硫酸銨（4.8），代替試料，按7.1.2或7.2.2 步驟進行操作，測得硫酸銨的質量分數為21.19± 0.2%，否則應檢查加堿、蒸餾和滴定各步驟是否正確。

7.1.3滴定

用7.1.2.1 或7.1.2.2 法蒸餾后的吸收液立即用0.1mol/L （4.6.1）或0.02mol/L（4.6.2）鹽酸標準溶液滴定，溶液由藍綠色變成灰紅色為終點。

7.2 推薦法

7.2.1試樣的消煮

稱取0.5～1g 試料(含氮量5～80mg)準確至0.0002g，放入消化管中，加2 片消化片(儀器自備)或6.4g混合催化劑，12mL 硫酸（4.1），于420℃下在消煮爐上消化1h。取出放涼后加入30mL 蒸餾水。

7.2.2氨的蒸餾

采用全自動定氮儀（5.11）時，按儀器本身常量程序進行測定。

采用半自動定氮儀（5.11）時，將帶消化液的管子插在蒸餾裝置上，以25mL  硼酸溶液為吸收液，加入2 滴混合指示劑（4.5），蒸餾裝置的（5.7）的冷凝管末端要浸入裝有吸收液的錐形瓶內，然后向消煮管中加入50mL  氫氧化鈉溶液進行蒸餾。蒸餾時間以吸收液體積達到100mL 時為宜。降下錐形瓶，用蒸餾水沖洗冷凝管末端，洗液均需流入錐形瓶內。

7.2.3滴定

用0.1mol/L標準鹽酸溶液（4.6.1）滴定吸收液，溶液由藍綠色變成灰紅色為終點。

8 空白測定

稱取0.5g蔗糖，代替試樣，按第七章進行空白測定，消耗0.1mol/L鹽酸標準溶液（4.6.1）的體積不得超過0.2mL。消耗0.02mol/L鹽酸標準溶液（4.6.2）體積不得超過0.3mL。

9.1計算見下式：

粗蛋白質（％）=（V2-V1）·c×0.0140×6.25/（m×V＇/V） ×100 

式中：V₂——滴定試樣所需標準溶液體積，mL；

V₁——滴定空白時所需標準酸溶液體積，mL；

C——鹽酸標準溶液濃度，mol/L；

m——試樣質量，g；

V——試樣分解液總體積，mL；

V′——試樣分解液蒸餾用體積，mL；

0.0140 ——每毫克當量氮的克數；

6.25——氮換算成蛋白質的平均系數。

9.2 重復性

每個試樣取兩個平行樣進行測定，以其算術平均值為結果。

當粗蛋白質含量在25％以上時，允許相對偏差為1％。

當粗蛋白質含量在10％～25％之間時，允許相對偏差為2％。

當粗蛋白質含量在10％以下時，允許相對偏差為3％。