ABSciex視頻講座“ABSciex電噴霧質譜在蛋白質組學中的應用”

　　4月12日，AB Sciex 公司在分析測試百科網成功舉辦了題為“AB Sciex 電噴霧質譜在蛋白質組學中的應用”的網絡視頻講座。AB Sciex 亞太應用支持中心的靳文海博士首先為大家簡單介紹了蛋白質組學和質譜技術發展方向，接下來重點講解了AB SCIEX Triple TOF 5600在發現蛋白質組學中的應用以及AB SCIEX QTRAP 5500在生物標志物研究中的應用。

　　蛋白質組學和質譜技術發展方向

　　蛋白質組學是非常龐大的一門學科，從2000年蓬勃發展到現在，研究的熱點已經從鑒定蛋白質轉移到蛋白質的定量。目前，面對的挑戰主要集中在四個方面：高動態范圍、復雜的翻譯后修飾、很難獲得低豐度蛋白質和無法準確測定完整的蛋白質組等。

　　蛋白質組學研究中質譜涉及的領域有：一是蛋白質鑒定（也包括發現蛋白質間的一些差異，進行初定量和半定量）主要依賴于質譜的靈敏度和分辨率，另一個是對蛋白質或肽段進行真正意義上的和功能相關的相對或絕對定量，這也是目前蛋白質組學研究的熱點，目標是要做到精確和實時定量。基于以上兩點，對質譜提出了明確要求，就是定性和定量的完美結合，但目前絕大多數質譜都是只能做定性或只能做定量。其中，定量分析中的線性動態范圍也是質譜的一個永恒追求。

　　AB SCIEX去年推出的 Triple TOFTM 5600質譜系統能同時滿足蛋白質組學研究中定性和定量的要求。隨后，靳博士為大家詳細的講解了AB SCIEX Triple TOFTM 5600在發現蛋白質組學中的應用。

　　AB SCIEX  Triple TOF? 5600在發現蛋白質組學中的應用

　　AB SCIEX  Triple TOF? 系統是目前為止最快，最靈敏的高分辨質譜，能夠充分滿足高標準的定性和定量分析的需要。

　　Triple TOF? 5600質譜系統

　　在一個平臺上同時涵蓋蛋白質組學的定性和定量研究，主要特點：

　　（1）高靈敏度。在全掃描和二級質譜掃描方式，靈敏度達到業界高端QQQ質譜的MRM水平，使得更多低豐度的蛋白質能被檢測和鑒定到；

　　（2）SmartSpeed? 100Hz采集速率。

　　 定性：單位時間內，相比任何質譜，中性丟失觸發 IDA掃描等方式的更多時間用在MS/MS上，保證質譜對復雜樣品的挖掘深度，提高對復雜樣品檢測的實際靈敏度，從而鑒定到更多的蛋白質；

　　 定量：不論MS或是MS/MS，都能獲得更多的數據點，使得定量數據更可靠；

　　（3）高分辨率。在MS和MS/MS，低分子量區和高分子量區，低掃描速度和高掃描速度下，都能達到高分辨率，滿足蛋白質組學中對分辨率的絕大多數要求，對從頭測序、iTRAQ提供最好的支持；

　　（4）EasyMass? 質量準確度，質量準確度小于1ppm（RMS），MS和MS/MS都能達到，從而提供最可信的蛋白質鑒定數據；

　　（5）線性動態范圍，真正的大于4個數量級，是所有高分辨質譜中定量能力最強的；

　　（6）可靠性，執行嚴格的工業可靠性標準，系統采用創新的磁懸浮分子渦輪泵，基本無機械損耗，低噪音。

　　Triple TOFTM 5600上具有未知物篩查（Explore）、多目標物同時定量/定性（Profile）以及定量分析（Quantify）這三個工作模式。靳博士各用一個實例展示了Triple TOFTM 5600在蛋白質組學上的應用。分別是：在蛋白質和肽段鑒定方面，采用Explore模式進行酵母細胞裂解物的胰酶消化產物的分析實驗；Profile模式下進行磷酸化肽段分析實驗，實現一次實驗同時定性定量等。

　　AB SCIEX QTRAP 5500在生物標志物研究中的應用

　　生物標志物的研究分為發現、驗證和確認。生物標志物“發現”的核心是發現差異，這些差異包括表達數量、表達位置和修飾狀態方面的差異。發現這些差異有助于發現疾病相關的特異性蛋白質，作為臨床診斷的分子標記或者作為治療和藥物開發的靶點。最常見的差異是表達量的差異即蛋白質的差異表達。生物標志物“驗證”的核心是“去除前期發現的假陽性”。

　　發現階段得到的蛋白質差異表達結果需要質譜進一步驗證才能夠被確認，發現階段和驗證階段所用的質譜種類不同，工作原理不同；驗證階段所用的工作模式，已被小分子特別是藥物研發領域譽為黃金標準，技術成熟。

　　AB SCIEX公司推薦給用戶采用Qtrap質譜系統進行生物標志物的驗證研究。AB SCIEX公司用于蛋白質組學分析的Qtrap質譜系統包括3200 QTRAP、4000 QTRAP和5500 QTRAP這三款產品。今天，靳博士主要給大家介紹了5500 QTRAP。

　　5500 QTRAP四極桿-線性阱雜交質譜儀

　　QTRAP質譜系統是一種雜合的質譜儀，將三重四級桿和線性離子阱組合型系統，三重四級桿的Q3能在1ms內實現QQQ和QqLIT兩種模式的轉換，避開了單獨QQQ和單獨LIT的缺點，結合了兩者的優點。

　　串聯四極桿--線性離子阱技術

　　 QTRAP質譜系統具備特有的MIDAS工作流程，該技術結合了Qtrap質譜儀串聯四極桿的高選擇性的MRM掃描和線性離子阱高靈敏度的MS/MS掃描功能。軟件能夠自動構成MRM離子對，MRM采集后，便迅速在離子阱內進行MS/MS全掃描。由于QTRAP質譜系統的第三個四極桿能夠在1ms的情況下切換成線性離子阱，使得MS/MS掃描靈敏度提高500倍左右，有效去除假陽性。

　　在肽段MRM定量方面AB有一款非常好的軟件—MRMPilot軟件，能夠自動、方便、直觀的建立MIDAS工作流程。在定量方法的建立和優化時，MRMPilot能自動生成質譜采集方法，將采集到得數據導入回軟件，進行MS分析。不僅大大提高了工作效率，更重要的是避免了整個定量數據假陽性的可能。

　　 采用MRM進行蛋白質定量的另一個重要的環節就是需要有內標，因此AB公司推出了一款mTRAQ?試劑，它是一種定量的內標，實現歸一化，提高定量實驗的重復性和一致性。其特點為：是一種非同重同位素標簽，基于iTRAQ?試劑發展而來（iTRAQ試劑是同重標簽），標記原理、方法和效率相同，實現了生物標志物發現和驗證兩個階段的無縫鏈接。.在MS或MS/MS，輕、重標記都有4amu的質量差異，這一點與iTRAQ試劑不同。也可以針對高質量碎片離子設計特定的MRM離子對：提高了特異性、降低了噪音（LC/MS的高質量端噪音較低）。 MRM的輕、重標記的離子對在Q1和Q3的質量數都是不同的。輕、重標記的肽段在色譜上表現為共洗脫。

　　最后，靳博士簡單的介紹了AB SCIEX公司位于上海的亞太技術應用支持中心（ASC），ASC 致力于為生命科學領域的研究者和AB的客戶提供快捷、全方位的一站式服務。

　　相關產品：QTRAP 5500 四極桿-線性阱復合型質譜儀

　           　TripleTOF? 5600質譜系統

　　問題與答案：

　　1、目前采用MRM做肽段和蛋白質定量的時候，發表的文獻里面采用QTRAP的比例高嗎：

　　 答：對于整個肽段MRM定量，從全球來講，是07年底到08年初才開始出現的方向，到目前有三年的時間，就個人感覺，最保守的估計有70%的文章采用的是AB的4000 QTRAP或5500 QTRAP 進行肽段MRM定量研究。

　　 2、直接使用QTRAP 5500能不能進行發現蛋白質組學的研究，在這方面5500和MALDI TOF-TOF 5800系統有什么區別？

　　答：QTRAP 5500 有離子阱的一部分功能，可以做蛋白質的鑒定，在發現蛋白質組學的研究方面QTRAP 5500要比MALDI TOF-TOF 5800差一些。QTRAP 5500主要是在對肽段定量方面去除前期發現的假陽性具有優勢。

　　3、5600是不是包含了5500的所有功能呢?

　　答：兩者都可以進行定量和定性研究。5600是Triple TOF，是高分辨率類型，在蛋白質定性和差異性表達能力更加突出；5500是QTRAP，既有三重四極桿又有線性離子阱的功能，在肽段定量和MRM定量方面更加突出。

　　4、MRM-IDA-EPI會不會影響掃描的靈敏度和準確性呢?

　　答：MRM-IDA-EPI是在普通的MRM掃描后加了EPI。整個時間和單純MRM相比，也就延長了大概十幾個毫秒左右，MRM的數目減少的非常少。但是可以利用EPI去除假陽性，相對于帶來的好處，速度的輕微減少可以忽略不計。

　　5、5600在做蛋白質翻譯后修飾方面優勢在哪里？

　　答：5600的最大的特點是掃描速度非常快，靈敏度非常高，在復雜混合物中低豐度的磷酸化肽段的鑒定方面很有優勢。而且能在一張圖譜上實現糖鏈結構和糖肽骨架結構同時分期。再加上5600的高分辨是不犧牲掃描速度的，在這個情況下，對于樣本的翻譯后修飾的鑒定，不論是磷酸化、糖基化還是其他翻譯后修飾甲基化等，性能都是突出的。

　　6、在蛋白差異方面研究中，兩種不同地域樣本的比較，什么樣的儀器方案更合適呢?

　　答：在差異表達研究方面，推薦個大家的還是Triple TOFTM 5600，iTRAQ 流程這個組合，因為在AB用戶中使用iTRAQ流程做這方面的研究還是比較成功的。使用這個工作流程，一次實驗最多能實現8組樣本的比較，所有處理和生物信息學分析都能提供自動化的軟件支持。

　　更多問題網友可以通過郵箱和靳老師聯系，靳老師郵箱：kerong.zhang@absciex.com

　　本次講座的PPT錄音文件參見網址：http://www.antpedia.com/corp/data-987.html