Cell：新型PROTAC，首次實現細菌內靶蛋白降解

　　細菌感染每年導致數十萬人死亡，尤其在中低收入國家。考慮到過去50年來僅有少量抗生素獲批，新抗生素的發展還面臨著細菌包膜的低滲透性以及特異性靶標少的挑戰。病原體對現有藥物產生耐藥性的速度進一步加劇了尋找有效抗菌劑的困難。鑒于這種不平等的軍備競賽，細菌性流行病的卷土重來是一個很大的威脅，迫切需要對抗感染的創新戰略。

　　藥物發現中的一個新興概念是誘導降解靶蛋白。對于真核生物來說，泛素-蛋白酶體系統是細胞內蛋白質降解的主要途徑，參與細胞內 80% 以上蛋白質的降解。泛素對蛋白質來說無異于“死神來了”，一旦被盯上，終將被摧毀。

　　最突出的合成“降解劑”是蛋白水解靶向嵌合體（PROTAC）：雙功能小分子，包括 E3 泛素連接酶結合部分和靶蛋白（POI）結合的化學部分。PROTAC 通過使 E3 連接酶和 POI 接近，促進 POI 泛素化和隨后的蛋白酶體降解。

　　與經典抑制劑相比，蛋白質降解劑具有多種優勢。例如，基于此種催化模式，它們表現出更高的降解效率。此外，PROTAC 幾乎可以靶向任何細胞蛋白質，并且它們兩個端口可以進行模塊化改造，允許改造蛋白質配體以設計出針對特異性靶蛋白的“降解劑”。

　　盡管有這樣的希望，PROTAC 技術迄今為止僅限于真核生物的泛素標記系統，尚未轉移到細菌的降解途徑中。實現細菌內的靶蛋白降解將為設計蛋白質功能調節劑和開發新型抗菌劑提供有吸引力的策略。

　　近日，奧地利維也納分子病理學研究所的 Tim Clausen 實驗室與德國杜伊斯堡-埃森大學的 Markus Kaiser 實驗室合作，在 Cell 期刊發表了題為：BacPROTACs mediate targeted protein degradation in bacteria 的研究論文。

　　該研究開發了一種新型小分子降解劑——BacPROTAC，基于細菌內的 ClpCP 蛋白酶降解系統，實現細菌內的靶蛋白降解，為抗菌劑開發提供了全新策略。

　　盡管泛素化是真核細胞獨有的，但在細菌體內，也存在一種與泛素-蛋白酶類似的蛋白降解系統——ClpC：ClpP（ClpCP）蛋白酶系統3。與識別復雜多聚泛素信號的真核蛋白酶體相比，ClpCP 蛋白酶識別機制要簡單得多：一個磷酸基團連接在靶蛋白的精氨酸殘基上，作為降解信號被 ClpCP 蛋白酶識別從而實現靶蛋白的降解。ClpCP 蛋白酶存在于革蘭氏陽性菌和分枝桿菌中，具有作為細菌蛋白降解劑中蛋白降解元件的潛力。

　　基于 ClpCP 蛋白酶降解系統，研究者以枯草芽孢桿菌 ClpCP 為蛋白降解原件，重新設計了由 POI 配體、化學接頭和 ClpCNTD 配體組成的 BacPROTAC。

　　這種模塊化的設計方式理論上可以降解細菌中的任何蛋白質。作為概念驗證，研究團隊在體外以單體鏈霉親和素（mSA）作為模型蛋白，通過連接基團將 pArg（ClpCNTD配體）與生物素（高親和力mSA配體）結合，形成 BacPROTAC-1 化合物。BacPROTAC-1 可結合 mSA 與 ClpCNTD，形成有活性的三元復合物，在100 μM劑量下可有效降解靶蛋白。

　　圖1 BacPROTAC-1 對枯草芽孢桿菌 ClpCP 的體外重編程

　　此外，已有研究報道 ClpC 在靜息狀態下是以一種 AAA 環被破壞的十聚體形式存在。當銜接蛋白 MecA 與 ClpC 相互作用，會促進功能性六聚體的重新組裝并激活 ClpCP 蛋白酶。然而尚不清楚大多數用 pArg 標記的 ClpC 底物是如何觸發 ClpC 十聚體的重塑。為了闡明這種基于 pArg 識別的激活機制，研究團隊對與 BacPROTAC-1 和 mSA-Kre 融合蛋白復合的 ClpC 進行了冷凍電鏡結構分析。

　　結果驚奇地發現，四個 ClpC 六聚體通過它們的盤繞線圈 M 結構域相互作用，排列成幾乎完美的四面體對稱。此外，為了以更高的分辨率解析激活的去折疊酶的功能單元，研究者還對單個六聚體進行了聚焦的低溫冷凍電鏡分析，提供了 ClpC 在展開 BacPROTAC 束縛底物過程中的快照。ClpC 24-mer 的結構表明 pArg 標記不僅用作降解信號，而且還介導高階寡聚體的形成和 ClpC 的激活。開發的含有 pArg 部分的 BacPROTAC 會觸發這種重塑機制，因此該雙功能小分子不僅可以作為化學接頭，而且可以作為 ClpCP 蛋白酶的激活劑。

　　然而，基于 pArg 設計的 BacPROTAC 藥代動力學較差，磷酸胍基團不穩定。為了克服這些限制，研究團隊尋找了一些可以替代 pArg 的 ClpCNTD 配體。其中，最具特征的 ClpCNTD 導向抗生素是 CymA，其結合位點在 ClpC1 去折疊酶中高度保守，但在革蘭氏陽性細菌的 ClpC 蛋白中不存在，從而能夠選擇性地靶向分枝桿菌蛋白酶。此外，CymA 還可以通過分枝桿菌的細胞包膜。并且由于細胞生物素會競爭與 mSA 結合并阻礙 BacPROTAC 活性，研究團隊進一步改造 BacPROTAC 的 POI 配體為 JQ1，其中 JQ1 是一種在 PROTAC 中應用廣泛的 BRDTBD1 配體（BRDT 是一種沒有細菌同源物的人類蛋白質，可以在不干擾內源性途徑的情況下進行選擇性的體內降解）。該數據證實 BacPROTAC 是一種多功能分子工具，可通過模塊化設計替換不同的靶蛋白配體與降解誘導模塊配體，應用于不同的蛋白質底物。

　　圖2：BacPROTACs 重新編程分枝桿菌 ClpCP

　　在進行了充分的蛋白水平表征后，需要評價 BacPROTAC 在細胞層面的活性。由于細菌中不表達 BRDTBD1 蛋白，研究團隊構建了穩定表達該蛋白的分枝桿菌。研究表明， BacPROTAC-3 以劑量依賴的方式降低細菌中 BRDTBD1 的水平；蛋白組學實驗結果證實，僅 BRDTBD1 被顯著性降解，說明該藥物具有良好的特異性。

　　圖3：BacPROTACs 介導分枝桿菌中靶蛋白選擇性降解

　　總的來說，該研究開發了一種新的雙功能小分子 BacPROTAC，將靶向蛋白質降解技術擴展到細菌。并且鑒于該雙功能小分子模塊化設計的優勢， BacPROTAC 可以開辟新的視野，開發具有高選擇性和物種特異性的抗菌劑。此外，BacPROTAC 除了具有新型抗菌劑的潛力外，還可以用于了解細菌蛋白質功能，從而發現新的藥物靶標。但是值得一提的是，該研究仍存在靶蛋白體內降解效率低下、BacPROTAC 低細胞滲透性等局限性，還需要進一步優化設計，并證明內源性細菌蛋白可以以相同的方式降解。