ELISA實驗

抗原 血清

碳酸鹽包被緩沖液 PBST BSA

96孔酶標板 4℃冰箱 恒溫培養箱 分光光度計

一、包被抗原

1. 用50mM 的碳酸鹽包被緩沖液（pH 9.6）溶解抗原，使抗原濃度為10-20 μg/ml，加100 μl/孔到96 孔酶標板，4℃放置過夜。

2. 第二天棄去包被液后，用PBST 洗滌3 次，每孔加入150 μl 1％ BSA 37℃封閉1 小時。

3. PBST 洗滌3 次后，每孔加入100 μl 不同倍比稀釋度的血清，并加入對照樣品，37℃孵育2 小時。

4. PBST 洗滌5 次后，加入100μl 稀釋后的HRP 標記的二抗，37℃孵育1 小時。

5. PBST 洗滌5 次后，顯色劑顯色20 min 后，酶標儀上讀取A405 吸收值。

二、包被細胞 

1. 在96 孔培養板上接種細胞數為1 x 104 cells/well，37℃過夜培養。

2. 第二天用PBS 洗滌培養板2-3 次。

3. 加入125 μl/well 10% Forma lin（1:10 稀釋）, 室溫下固定15 min。

4. 用ddH2O 洗滌培養板3 次，并晾干，儲藏在2-8℃備用。

5. 用PBST 洗滌3 次，每孔加入150 μl 1％ BSA 37℃封閉1 小時。

6. PBST 洗滌3 次后，每孔加入100 μl 不同倍比稀釋度的血清，并加入對照樣品，37℃孵育2 小時。

7. PBST 洗滌5 次后，加入100 μl 稀釋后的HRP 標記的二抗,37℃孵育1 小時。

8. PBST 洗滌5 次后，顯色劑顯色20 min 后，酶標儀上讀取A405 吸收值。50mM 的碳酸鹽包被緩沖液：0.05mol/L pH9.6 碳酸緩沖液,4℃，保存,Na2CO3 0.15 克, NaHCO3 0.293 克,蒸餾水稀釋至100 ml。                                                                                                                    

ABTS 作為底物進行顯色反應(10ml)：

 0.2M Na2HPO4 2.4ml

 0.1M 檸檬酸2.6ml

ddH2O 5ml

ABTS 5mg

H2O2(30%) 4 ul（用前加入）

血清標本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內源性HRP，也會產生假陽性反應。如在冰箱中保存過久，其中的可發生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。一般說來，在5天內測定的血清標本可放置于4℃，超過一周測定的需低溫冰存。凍結血清融解后，蛋白質局部濃縮，分布不均，應充分混勻宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和，不要在混勻器上強烈振蕩。混濁或有沉淀的血清標本應先離心或過濾，澄清后再檢測。反復凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時就應注意無菌操作，也可加入適當防腐劑。

按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應為新鮮的和高質量的。自配的緩沖液應用pH計測量較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱保存。