ELISA方法的基本類型、用途及操作程序

酶聯免疫吸附試驗 (以下簡稱ELISA) ：是酶免疫測定技術中應用最廣的技術。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體 ( 聚苯乙烯微量反應板 ) 表面，使酶標記的抗原-抗體反應在固相表面進行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。常用的 ELISA 法有雙抗體夾心法和間接法，前者用于檢測大分子抗原，后者用于測定特異抗體。

根據ELISA所用的固相載體而區分為三大類型：一是采用聚苯乙烯微量板為載體的ELISA，即我們通常所指的ELISA（微量板ELISA）；另一類是用硝酸纖維膜為載體的ELISA,稱為斑點ELISA（Dot-ELISA）;再一類是采用疏水性聚脂布作為載體的ELISA，稱為布ELISA（C-ELISA）。

在微量板ELISA中，又根據其性質不同分為間接ELISA、雙抗體夾心ELISA、雙夾心ELISA、競爭ELISA、阻斷ELISA及抗體捕捉ELISA。

1、間接ELISA

本法主要用于檢測抗體。以鴨病毒性肝炎（DVH）抗體的ELISA為例，間接ELISA的操作程序如下：

(1) 材料

① 包被液、洗滌液、保溫液、底物液、終止液；

② DVH包被抗原、酶標抗抗體、陰性及陽性DVH參考血清；待檢鴨血清；

③ ELISA檢測儀、加樣器、聚苯乙烯微量板。

(2) 方法步驟

① 加抗原包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋干

② 加待檢血清 → 37℃ 2小時，洗滌三次、拋干

③ 加酶標抗體 → 37℃ 2小時，洗滌三次、拋干

④ 加底物液 → 37℃ 30分鐘，加終止液

⑤ 用ELISA檢測儀測定OD值，并計算出P/N比值。

(3) 結果判定 已知陽性血清與已知陰性血清的比值（P/N）≥2.1，而且已知陽性血清的OD值≥0.4；在上述條件成立的情況下，如果待檢血清與已知陰性血清的比值（P/N）≥2.1，而且待檢血清的OD值≥0.4，則判為陽性，否則判為陰性。

2、雙抗體夾心ELISA

本法主要用于檢測大分子抗原。現以檢測雞傳染性法氏囊病病毒（IBDV）的雙夾心抗體ELISA為例介紹本法的操作程序。

① 加抗體包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋干

② 加待檢抗原 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋干

③ 加酶標抗體 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋干

④ 加底物液 → 37℃ 15分鐘，加終止液

⑤ 用ELISA檢測儀測定OD值。

3、雙夾心ELISA

此法與雙抗體夾心ELISA的主要區別在于：它是采用酶標抗抗體檢查多種大分子抗原，它不僅不必標記每一種抗體，還可提高試驗的敏感性。

此法的基本程序為：

① 加抗體（Ab-1）包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋干

② 加待檢抗原（Ag） → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干

③ 加用非同種動物生產的特異性抗體（Ab-2）→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干

④ 加入酶標抗Ab-2抗體（AB-3）→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干

⑤ 加底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液

⑥ 用ELISA檢測儀測定OD值。