ELISA檢測噬菌體抗體與目的抗原的親和力

實驗概要

本實驗利用ELISA檢測了噬菌體抗體與目的抗原的親和力。

主要試劑

1. 0.5mol/L Na₂CO₃(pH9.6)

2. 1％BSA

3. HRP標記的抗M13噬菌體多抗

4. 2mol/L H₂SO₄

主要設備

1. 酶標板

2. 酶標儀

實驗步驟

1. 將抗原用PBS或0.5mol/L Na₂CO₃(pH9.6)稀釋至10μg/ml；

2. 對于要檢測的每個克隆，至少包被2個孔，每孔用200μl稀釋抗原。同時包被陰性對照抗原。此外，包被陽性對照抗原，陽性對照抗原用anti-M13抗體；

3. 室溫包被1～2h，最好于4℃過夜包被，甩掉孔中液體，倒置于紙巾上空干。

4. 每孔中用至少200μl 1％BSA封閉，37℃1h。去掉液體后空干。

5. 將重組噬菌體事先用等體積的封閉液于室溫下封閉15min～30min，以封閉各種蛋白質之間的非特異性結合位點。

以M13噬菌體作為陽性對照噬菌體，也按上述步驟操作。

6. 在每個包被抗原孔中，加入稀釋的重組噬菌體懸液200μl，37℃ 1～2h。在包被了陽性對照抗原的孔中，加入200μl陽性對照噬菌體。

7. 去掉孔中液體，倒置于紙巾上。將板浸入PBS/0.5％ Tween20(PBST)中，振蕩趕走氣泡，將板取出。重復洗滌５遍。

8. 將板倒置于紙巾上，去掉所有液體。

9. 將HRP酶標的Anti-M13抗體用封閉緩沖液稀釋至合適濃度。

10. 在每孔中加入200μl HRP/Anti-M13稀釋液。

11. 37℃溫育1h。按前述方法洗滌6次。

12. 每21ml 1×ABTS底物溶液中加入36μl 30％ H₂O₂。在每孔中加入200μl。

13. 置室溫20～60min，直至出現適中的顏色反應。加入2mol/L H₂SO₄終止反應。

14. 于415nm波長下用酶標儀讀出光吸收值。良好的數據中，噬菌體抗體與篩選抗原的吸收值應當比陰性對照抗原的吸收值高2～3倍。