ELISAprotocol

ELISA protocol：
1.取5－10ul BMMY表達上清用0.05M NaHCO3稀釋到100ul鋪ELISA板，37度或室溫振蕩大于1小時。注意一定要做一個GS115空菌株表達上清作為陰性對照，最好還找一個帶有histag的蛋白作為陽性對照。
2.TPBS洗板3次，方法：倒掉鋪板液，倒置于毛巾上輕輕拍打幾次，加TPBS至滿，重復。
3.加封閉液（TPBS加1％脫脂奶粉）350ml/孔，室溫下放置40分鐘－1小時，TPBS洗3次。
4.加封閉液稀釋的histag一抗100ul/孔，ELISA板于室溫振蕩0.5－1小時，TPBS洗3次。很多公司都有histag的單抗，個人覺得Qiagen和Pharmacia單抗較好，Invitrogen和Labvision的一般般，一般1：1000－5000稀釋，不同公司的抗體效價不同。
5.加封閉液稀釋的HRP標記的羊抗鼠二抗100ul/孔，ELISA板于室溫振蕩0.5－1小時，TPBS洗3次。二抗很多公司有，國產的華美都可以，1：500－1000。如果是HRP標記的histag抗體，不加二抗直接顯色。
6.加入OPD顯色液100ul/孔，避光反應約10－30分鐘。顯色液配方：1mg/ml OPD于0.1M 檸檬酸鈉，PH5.5，0.1%H2O2，－20度避光保存。也可以用DAB顯色。
7.1M H2SO4 100ul/孔終止反應，酶標儀測OD490nm。