NK細胞活性檢測實驗步驟

　　細胞毒檢測技術包括補體依賴細胞毒試驗、NK細胞介導的細胞毒試驗和特異性CTL活性檢測，常用的實驗技術有后兩種。NK細胞（natural killer cell）是在天然免疫系統發揮主要作用的效應細胞，可直接殺傷病毒感染的靶細胞和某些腫瘤細胞。而細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）則是特異免疫系統發揮特異殺傷作用的效應細胞，可特異殺傷病毒感染細胞和腫瘤細胞。本節介紹乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測NK細胞活性。

　　乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測NK細胞活性

　　乳酸脫氫酶(LDH)是活細胞胞漿內含酶之一。在正常情況下，不能透過細胞膜。當靶細胞受到效應細胞的攻擊而損傷時，細胞膜通透性改變，LDH可釋放至介質中，釋放出來的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的過程中，使氧化型輔酶I(NAD+)變成還原型輔酶I (NADH2），后者再通過遞氫體-吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)還原碘硝基氯化氮唑藍(INT)或硝基氯化四氮唑藍(NBT)形成有色的甲簪類化合物，在490nm或570nm波長處有一高吸收峰，利用讀取的OD值，經過計算即可得NK細胞活性，步驟如下：

　　1．靶細胞制備

　　取培養24～48h的靶細胞，洗滌3次，最后用完全RPMI-1640培養液調整細胞濃度至1×105／ml，備用。

　　2．效應細胞的制備

　　常規方法分離PBMC或小鼠脾細胞，洗滌3次，最后用完全RPMI-1640培養液調整細胞濃度至1×l07／ml。

　　3．效-靶細胞作用

　　將效應細胞和靶細胞各0.1ml(E/T＝100∶1)加入40孔細胞培養板的孔中，每份標本設3復孔，同時設靶細胞自然釋放對照組和最大釋放對照組(0.1ml靶細胞＋0.1ml 1％NP-40液)，低速離心1000r／min，2min后，置37℃、5％CO2溫箱中孵育2h。

　　4．酶促反應

　　取出培養物，吸取各孔上清0.1ml加于另一培養板孔中，置37℃預溫10min，每孔加入新鮮配制的LDH底物溶液0.1ml，室溫避光反應10～15min，每孔加入1mol/L檸檬酸終止液30μl，以終止酶促反應。

　　5．結果計算

　　用酶聯檢測儀在570nm波長下讀取各孔OD值，并計算NK細胞活性。

　　NK細胞活性(％)=■×100％

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