Nature子刊|堿基編輯器新拓展

作為Cas9核酸酶的進化祖先，IscB蛋白作為緊湊RNA引導的DNA內切酶和缺口酶，使其成為堿基編輯的強有力候選者。然而，目標范圍狹窄限制了IscB系統的應用;因此，有必要找到更多識別不同靶鄰基序(TAMs)的IscB。

2024年8月15日，輝大基因張海南、李彤、復旦大學黃錦海、中科院腦科學與智能技術卓越創新中心楊輝共同通訊在Nature Chemical Biology（IF=13）在線發表題為”Engineered IscB–ωRNA system with expanded target range for base editing“的研究論文，該研究開發的工程IscB -ωRNA系統能夠擴展目標范圍的堿基編輯。

在這里，研究人員從未培養的微生物中鑒定出19種未表征的IscB蛋白中的10種，這些蛋白在哺乳動物細胞中具有活性。通過蛋白質和ωRNA工程，進一步增強了其同源物IscB的活性。并將其TAM范圍從MRNRAA擴展到NNNGNA，產生名為IscB.m16*的變體。通過將脫氨酶結構域與IscB融合。m16* nickase，生成IscB。m16*衍生的堿基編輯器在哺乳動物細胞中表現出強大的堿基編輯效率，并通過單次腺相關病毒傳遞有效地恢復患病小鼠的杜氏肌營養不良蛋白。因此，該研究為基礎研究和治療應用建立了一套緊湊的堿基編輯工具。

CRIPSR-Cas系統，如II型Cas9和V型Cas12系統，作為針對病毒的原核適應性免疫系統，已發展成為基礎研究和基因治療中的基因組編輯工具。工程Cas9缺口酶(nCas9)或失活Cas9 (dCas9)版本融合了各種結構域，已經建立了堿基編輯、引物編輯和表觀基因組編輯技術。然而，Cas9和Cas12的大容量，特別是基于nCas9的基因編輯工具，阻礙了基于腺相關病毒(AAV)載體的基因編輯的應用。目前已經報道了緊湊的Cas9、Cas12f同源基因(400 - 700 aa)和Cas12的祖先分支TnpB(~400 aa)。然而，由于它們的編輯活性差或缺乏HNH結構域，這些蛋白質的堿基編輯活性有限。

IscB蛋白編碼在具有HNH和RuvC結構域的IS200/IS605轉座子家族中，如Cas9，并且被認為是Cas9的祖先。然而，IscB蛋白的大小僅為Cas9的五分之二(~ 400aa)。最近的研究表明，IscB系統(IscB -ωRNA)是一種可編程的長鏈非編碼RNA (ωRNA)引導的DNA核酸內切酶，基于ogeuiscb的工程堿基編輯器(enOgeuIscB-BEs)在哺乳動物細胞中具有較高的堿基編輯效率。IscB系統需要一個3 '端靶向鄰近基序(TAM)來識別目標DNA(通常為6 nt)，而最近報道的enOgeuIscB需要4 nt (NWRRNA)。復雜的TAM序列大大減少了可編輯的位點數量。OgeuIscB在哺乳動物細胞中的TAM范圍較窄，已成為其明顯的局限性。因此，有必要開發效率更高、TAM范圍更廣的微型堿基編輯器。

功能性IscB同源物的鑒定與表征（圖源自Nature Chemical Biology）

在這里，作者從宏基因組數據集中鑒定了19個具有不同TAM范圍的天然IscB -ωRNA系統。通過設計ωRNA和IscB。m16蛋白，生成了IscB。m16*系統(IscB)m16含有E326R、T459E、P460S、T462H取代(IscB.m16RESH)和ω RNA)，具有較強的編輯活性，并將TAM范圍擴大到哺乳動物細胞中的NNNGNA。進一步發展了IscB。基于M16 *的腺嘌呤和胞嘧啶堿基編輯器在哺乳動物細胞和小鼠模型中顯示出強大的堿基編輯效率和廣泛的靶標識別。此外，還提供了具有不同TAM范圍的IscB -ωRNA系統的綜合數據集和擴大TAM范圍的策略。總體而言，工程緊湊型IscB衍生堿基編輯器已被證明是在哺乳動物細胞和疾病小鼠模型中高效、特異性和寬范圍DNA堿基編輯的平臺，突出了它們在基因治療中的潛力。

參考消息：

https://www.nature.com/articles/s41589-024-01706-1