T細胞克隆的建立

基本方案 1 產生和維持同種反應性 T h 和 CTL 克隆

盡管同種反應性 T 細胞可以從未刺激的脾細胞或淋巴結細胞中產生，但如果細胞在初次混合淋巴細胞（M L C ) 中第一次被同種抗原刺激，反應細胞的得率會更高。見以下介紹。

材 料

同種反應性小鼠脾臟 T 細胞

V H B S S (可選使用）

V D M E M -20 完全培養基

經 照 射 的（2000rad，單 元 2. 1 1 ) 同種異基因型小鼠脾臟 T 細胞

生長因子： M L C 或 Con A 刺激的細 胞 上 清（見輔助方案 1 或 2)，重組細胞因子

9 6 孔 平 底 培 養 板（Costar)

2 4 孔 細 胞 培 養 板（Linbro， Costar

1 . 在體外用同種異型抗原致敏同種反應性 T 細 胞 10?M d (見 輔 助 方 案 2 , 步 驟 1)，最好使用 H B S S 或 D M E M 溶 液（即與小鼠血清等滲的溶液）。

2 . 準備再次刺激用的 M L C (見輔助方案 2 , 步 驟 3)，培 養 36?48 h 。

3.將經照射（2000rad) 的同種異 型 脾 T 細 胞 ，用 D M E M -2 0 培養基調節細胞濃度為IO7 個細胞/m l ，每 孔 100ul 加 入 到 9 6 孔平底板中。

4 . 從再次刺激用的 M L C 體 系 中 收 集 T 細 胞（步 驟 2)，重 懸 于 D M E M -20 中并計數(附錄 3A )。

5.將重懸的 T 細 胞 用 M L C 或 Con A (作為細胞因子）激 活 的 上 清 稀 釋 到 1?1 0 個細胞/m l ， 50ul 每孔加入步驟 3 的 9 6 孔板中， 37°C 培 養 4d。

6 . 在每孔中加入 50ul M L C 激活的上清和 5 〇 M D M E M -I O 培養基。培 養 7 ?IOd 直到在倒置顯微鏡下可在一些孔中觀察到有明顯的細胞集落形成。

7a. 用 51C r 微量釋放實驗檢測細胞毒活性：用 51C r 微 量 釋 放 實 驗 檢 測 細 胞 毒 活 性（Engers and Fitch; 單 元 2. 10)，區分同種反應性 C T L 和 T h 細胞。如果細胞毒活性試驗顯示陰性，進一步用單元 2. 1 1 所示的增殖試驗檢測 T h 細胞的存在。

7b. 檢 測 IL-2 或 IL-4 的產生：用 抗 原（單 元 5. 1 ) 再 次 刺 激 檢 測 IL-2 或 IL- 4 的產生，或用表面表達 C D 4 或 C D 8 (單 元 4. 1 和單元 4. 2 ) 篩選。

8 . 鑒定同種反應性 T 細胞克隆是否具有應有的特征（特異的細胞毒活性和特異性細胞因子的產生）。

9 . 按如下方法維持克隆的細胞：從原來的 9 6 孔板轉移 IOOiUl 細 胞 懸 液（含 2. 5 X IO4?I X lO5 個細胞）到 0. 9m l 含 6 X lO 6 個經照射的同種異型脾細胞和 0. 5 ml M L C 激活的上清的 2 4 孔細胞培養板，補 加 D M E M -20 培養基使終體積達每孔 I.5m l 。每隔一周按此種方法傳代細胞。

基本方案 2 用可溶性蛋白抗原誘導 T h 克隆

不 要 臆 斷 T C R 轉基因小鼠是單克隆性的，因為它們會含有內源性 T C R 基因重排的細胞。

材 料

m a n ， 1982)。

9.一旦獲得足夠數量的細胞，通 過 檢 測 IL-2、 IL-4 和 IFN-Y 的 產 生（單 元 5 . 1 ) 鑒定新產生的克隆。

生 長 因 子 來 源 的 條 件 培 養 基 的 制 備

在選擇一種條件培養基之前必須考慮的一個重要因素是，每種培養基包含不同的細胞因子譜。

輔助方案 1 制備刀豆蛋白 A 活化的上清（C c m A 上清）

輔助方案 2 制備混合淋巴細胞培養上清（M L C 上清）

輔助方案 3 制備 P M A 激活的 E L -4 淋巴瘤細胞上清（E L -4 上清）

輔助方案 4 用顯微操作的方法克隆

與有限稀釋法比較，更推薦使用重復顯微操作的方法培養克隆，它是確保克隆形成能力的唯一方法。

附 加 材 料（其 他 材料 見基 本 方案 2)

微 毛 細 管（如微量血細胞比容管， BectonDickinson)