PCR常見問題總匯(二）
克隆PCR產物1)克隆PCR產物的最優條件是什么？最佳插入片段：載體比需實驗確定。1：1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數比1：8或8：1也行。應測定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時，或4oC過夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會自連，產生藍斑。室溫保溫1小時能滿足大多數克隆要求，為提高連接效率，需4oC過夜。2)PCR產物是否需要用凝膠純化？如凝膠分析擴增產物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數也很高，這會產生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。3)如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對照實驗？A）涂布未轉化的感受態細胞。如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質粒，或產生氨芐抗型的菌落。B）轉化完整質粒，計算菌落生長數，測定......閱讀全文
PCR常見問題總匯(二）
克隆PCR產物1)克隆PCR產物的最優條件是什么？最佳插入片段：載體比需實驗確定。1：1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數比1：8或8：1也行。應測定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時，或4oC過夜。在這2種溫
PCR常見問題總匯
PCR產物的電泳檢測時間 一般為48h以內，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規則甚致消失。 假陰性，不出現擴增條帶 PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及， ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。 模板：①模板中含有
PCR常見問題總匯
PCR產物的電泳檢測時間 一般為48h以內，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規則甚致消失。?假陰性，不出現擴增條帶 PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及，?④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。 模板：①模板中含有雜蛋白質，②模
PCR常見問題總匯
PCR產物的電泳檢測時間 一般為48h以內，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規則甚致消失。假陰性，不出現擴增條帶 PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及， ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。 模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板
PCR常見問題總匯(三）
PCR反應體系與反應條件 標準的PCR反應體系： 10×擴增緩沖液 10ul 4種dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq DNA聚合酶
PCR常見問題總匯(一）
PCR產物的電泳檢測時間 一般為48h以內，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規則甚致消失。?假陰性，不出現擴增條帶 PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及， ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。 模板：①模板中含有雜蛋白質，②模
PCR常見問題匯總（二）
PCR反應體系與反應條件-------------------------------------------------------------------------------- ? 標準的PCR反應體系：10×擴增緩沖液 10ul4種dNTP混合物 各200umol/L引物 各10～100p
定量PCR常見問題(二)
8.??????什么是背景校正？多長時間執行一次背景校正？????背景校正程序測量定量PCR儀所使用的反應管和水的空白熒光強度。在運行校正程序期間，定量PCR儀在10分鐘內連續讀取背景校正板的熒光強度，信號收集的溫度為60 °C。隨后，SDS軟件計算所收集到的熒光強度的平均值，提取結果并保存到校正文
實驗室透析實驗常見問題總匯
Q1：如何準備透析膜管？透析膜管的準備因膜管材質和生產工藝的差別而有所不同。注意，我們不推薦煮沸處理，因其可能損壞膜管并改變膜孔徑。生物技術級RC、CE及PVDF膜可以用DI水沖洗15-30分鐘，去除防腐劑疊氮化鈉。Spectra/PorR?7?標準級RC膜已經預處理，去除了重金屬和硫化物，只需在去
HPLC常見問題和解決方法總匯
壓 力 異 常 操作壓力的變化往往是故障的征兆。從下表中找出所觀察到的現象，并在右側的列表中參考相應的解決方法。 A、 沒有壓力顯示，沒有流動相流動 原 因 解決方法 1、電源問題 1、接通電源，開機 2、保險絲被燒壞 2、更換保險絲 3、
地下管線探測儀常見問題總匯
地下管線探測儀可以探多少米深的管線?主要可以運用到哪些行業?工作原理是什么?可不可以在電纜帶電運行的時候進行檢測?是如何進行工作的?有幾種頻率選擇???? 地下管線探測儀由來:地下管線是城市基礎設施的重要組成部分。城市地下管線包括給水、排水、燃氣、熱力、電信、電力、工業管道等幾大類,它就像人體內的“
PCR常見問題及解決方案（二）
問題可能原因解決方法無產物或產量低模板濃度偏低或偏高電泳檢測模板濃度，調整模板用量模板降解重新制備；基因組DNA、cDNA應小量分裝后低溫保存模板中含有抑制反應的雜質純化模板引物濃度不足調整引物濃度，特別是針對長片段PCR引物存在二級結構重新設計引物，避免二級結構；優化退火溫度引物降解引物應高濃度小
毛細管柱知識總匯（二）
氣相色譜柱固定相簡介 毛細管色譜柱最常用的是聚硅氧烷和聚乙二醇，另外還有一類是小的多孔粒子組成的聚合物或沸石(例如氧化鋁、分子篩等)。 1、聚硅氧烷 聚硅氧烷由于其用途廣泛、性能穩定性，是目前最常用的固定相。標準的聚硅氧烷是由許多單個的硅氧烷鏈接而成。每個硅原子與兩個功能集團相連，最常見的功能集團為
PCR常見問題
PCR產物的電泳檢測時間? 一般為48h以內，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規則甚致消失。 假陰性，不出現擴增條帶 PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及， ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。 模板：①模板中含有雜蛋白質，②模
PCR常見問題
PCR產物的電泳檢測時間 一般為48h以內，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規則甚致消失。?假陰性，不出現擴增條帶 PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及， ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。 模板：①模板中含有雜蛋白質，②模
PCR實驗操作常見問題及解決方法（二）
二、Generacer如何針對Generacer試劑盒設計基因特異性引物（GSP）？使用5’或3’RACE試劑都需要至少一條基因特異性引物，您在設計引物時需要注意以下幾點要求：*50-70％的GC含量，以提高引物熔點（Tm）*23-28個堿基長度，以提高引物特異性*降低3’端GC含量，將引物非特異性
PCR常見問題匯總
PCR產物的電泳檢測時間一般為48h以內，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規則甚致消失。假陰性，不出現擴增條帶PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及，④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶
PCR常見問題集錦
PCR產物的電泳檢測時間 一般為48h以內，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規則甚致消失。?假陰性，不出現擴增條帶 PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及， ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。 模板：①模板中含有雜蛋白質，②模
PCR常見問題匯總
PCR產物的電泳檢測時間 一般為48h以內，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規則甚致消失。假陰性，不出現擴增條帶 PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及， ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。 模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板
PCR常見問題總（3）
PCR反應體系與反應條件標準的PCR反應體系： 10×擴增緩沖液 10ul 4種dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2
PCR常見問題總（2）
克隆PCR產物1)克隆PCR產物的最優條件是什么？最佳插入片段：載體比需實驗確定。1：1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數比1：8或8：1也行。應測定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時，或4℃過夜。在這2種溫度
PCR常見問題總（1）
PCR產物的電泳檢測時間 一般為48h以內，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規則甚致消失。?假陰性，不出現擴增條帶 PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及， ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。 模板：①模板中含有雜蛋白質，②模
PCR克隆常見問題分析
??? 1、克隆PCR產物的最優條件是什么？??? 最佳插入片段：載體比需實驗確定。1:1（插入片段:載體）常為最佳比，摩爾數比1:8或8:1也行。應測定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時，或4℃過夜。在
定量PCR常見問題(一)
1.??????定量PCR儀的開關機順序是怎樣的？????按照正確的開關機順序操作，有助于延長儀器的使用壽命，減少儀器出故障的頻率。開機順序：先開電腦，待電腦完全啟動后再開啟定量PCR儀主機，等主機面板上的綠燈亮后即可打開定量PCR的收集軟件，進行實驗。關機順序：確認實驗已經結束后，首先關閉信號收集
PCR常見問題匯總（一）
PCR產物的電泳檢測時間一般為48h以內，有些zui好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規則甚致消失。?假陰性，不出現擴增條帶PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及，④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。模板：?①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有
PCR常見問題及對策
PCR常見問題及對策（一）沒有得到擴增產物（1）酶失活或在反應體系中未加入酶。Taq?DNA聚合酶因保存或運輸不當而失活，往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結果。（2）模板含有雜質。特別是對甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結果。（3）變性溫度是否準確：PCR
PCR常見問題及回答
?PCR常見問題及回答?1. cDNA產量的很低?可能的原因：*RNA模板質量低*對mRNA濃度估計過高*反應體系中存在反轉錄酶抑制劑或反轉錄酶量不足*同位素磷32過期*反應體積過大，不應超過50μl?2. 擴增產物在電泳分析時沒有條帶或條帶很淺?*zui常見的原因在于您的反應體系是PCR的反應體系
PCR儀常見問題及回答
PCR儀常見問題及回答1. cDNA產量的很低可能的原因：＊RNA模板質量低＊對mRNA濃度估計過高＊反應體系中存在反轉錄酶抑制劑或反轉錄酶量不足＊同位素磷32過期＊反應體積過大，不應超過50μl2. 擴增產物在電泳分析時沒有條帶或條帶很淺＊zui常見的原因在于您的反應體系是PCR的反應體系而不是R
PCR儀常見問題及回答
1. cDNA產量的很低可能的原因：*RNA模板質量低*對mRNA濃度估計過高*反應體系中存在反轉錄酶抑制劑或反轉錄酶量不足*同位素磷32過期*反應體積過大，不應超過50μl2. 擴增產物在電泳分析時沒有條帶或條帶很淺*最常見的原因在于您的反應體系是PCR的反應體系而不是RT-PCR的反應體系*與反
定量PCR技術常見問題交流
1. ?如果擴增曲線ct值比較靠后的話，32左右，一般有什么方法解決沒有 ct值比較靠后，對實驗有一定的影響，因為經過那么多次的循環，酶的活性有可能有所下降，這時候擴增效率會有所改變（而定量PCR的理論基礎就是每次循環的擴增效率我們認為是確定的一個值）。因此最好能夠把ct值往前移。 解決辦法可以將模