單細胞測序技術(singlecellsequencing)綜述（二）

DroNC-seq

10月，Broad研究所張鋒教授團隊在Nature Methods上發表題為“Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq with DroNc-Seq (doi: 10.1038/nmeth.4407)” 的文章，提出了一個新的測序技術：DroNc-Seq單細胞表達譜分析技術。該技術融合了sNuc-Seq技術與微流控技術的單細胞核RNA測序方法，可以在結構復雜的組織中更有效地分析大量細胞或細胞核中的RNA，開啟單細胞核測序的規模化時代。

在利用單細胞技術來研究大腦等復雜組織的基因表達時，研究人員總會覺得困難重重，因為復雜組織不易分離，難以辨別，分離細胞的過程會經常破壞目的神經元和RNA。sNuc-seq則利用單個提取的細胞核作為起始材料，通過觀察細胞核去理解不同的細胞類型和動態過程，如神經的形成。但sNuc-Seq是一種低通量的技術，其應用規模受到了限制。為擴大研究的應用規模，實現一次可研究數千個細胞核的高效測序，研究團隊將目光轉向了Drop-Seq。它將單細胞與帶有DNA條碼的微珠一起包裹在微滴中，大大加速表達譜分析實驗，同時降低成本。最終，他們開發出了融合兩種技術的DroNc-Seq方法。為檢驗方法的準確性與效率，研究人員利用DroNc-Seq對小鼠細胞系和腦組織進行了分析，并與Drop-Seq、sNuc-Seq以及其他較低通量的單細胞RNA-Seq方法進行比較。結果顯示DroNc-Seq表現出了靈敏、高效且無偏向的細胞分類能力。該技術很可能用于人體細胞圖譜計劃項目。

SISSOR

11月加州大學圣地亞哥分校張鹍教授團隊在PNAS上發表題為“Ultra-accurate Genome Sequencing and Haplotyping of Single Human Cells (doi: 10.1073/pnas. 1707609114)”的文章。開發了一個名為“SISSOR” (微流體反應器法單鏈測序)的方法，用來進行準確的單細胞基因組測序和單倍體分型。

正常人類單個細胞DNA含量為6.6pg，相對于測序所需的ug級相當微量，并且有些DNA是獨一無二的，因此單細胞測序的關鍵一環是全基因組擴增(WGA)，常見的方法如，MDA、MALBAC等需要用DNA聚合酶對細胞基因組做大量的體外擴增，然后構建文庫進行相對讀長較短的高通量測序。這些方法有兩個明顯的缺點：1，聚合酶的錯誤擴增可以在基因組上產生成千上萬的假陽性。2，短的序列讀長幾乎不包含任何單倍體類型信息。

SISSOR方法是利用微流體處理器將單個細胞染色體DNA的正負雙鏈進行分離，并將百萬堿基大小的DNA片段隨機分割成大量的納升級的組分，用于擴增和構建測序文庫，從而實現對同源染色體的互補雙鏈分別進行獨立的測序。這樣就能夠進行Long-range單倍體的組裝，并且還能利用冗余和單倍體型信息糾正測序錯誤。結果顯示，該方法的糾錯能力可以將單細胞測序錯誤率降低至10-8，并且單倍體片段平均可組裝長度為500 kb，contig達到N50大于7 Mb。該方法能夠獲得精準的單細胞基因組序列以及單倍體信息以滿足臨床對基因組測序的不同需求。SISSOR是對單細胞測序技術的一次突破，將測序準確性提高了兩個數量級。這項技術潛在的應用包括對患者血液中循環腫瘤細胞進行準確的檢測，以及對體外受精的健康胚胎進行篩選和檢測經過基因編輯的人體細胞。

snDrop-seq+scTHS-seq

張鹍教授團隊本月又在Nature Biotechnology雜志上發表了“Integrative single-cell analysis of transcriptional and epigenetic states in the human adult brain (doi: 10.1038/nbt.4038)”的文章。開發了基于冰凍組織高通量單細胞核測序方法來繪制成年人腦第二代單細胞圖譜，再次引爆了單細胞研究的熱點。

研究人員將視線聚焦于腦組織提取的神經元和膠質細胞單細胞核，克服了樣本的限制，使該方法可以應用于新鮮或凍存的腦組織，實現了凍存組織的大規模單細胞檢測。另外，這項研究的一個創新之處在于結合了兩種高通量單細胞技術：基于微流體的單核測序 (snDrop-seq) 和單細胞轉座子超敏感位點測序 (scTHS-seq)的方法。snDrop-seq，不僅可以對成千上萬個單細胞同時進行轉錄組分析，從多方面對細胞類型和細胞狀態進行分類，還可用于評估新鮮和凍存人體組織中的特異性表達譜，有助于研究組織的功能異質性。該技術還攻克了在微滴中有效裂解核膜而不引起RNA過度降解的難題。為同時研究表觀遺傳特征，該團隊還開發了scTHS-seq技術。scTHS-seq擁有具有體外轉錄擴增的線性優勢和改造后的超級突變Tn5轉座酶，比ATAC-seq靈敏度更高，還提高了高度細胞特異性的遠端增強子(distal enhancers)的覆蓋度。

研究團隊聯合應用以上兩種方法最終建立了這種可并行檢測細胞核轉錄本和表觀遺傳特征的高通量測序平臺，為綜合分析凍存人體組織樣本中基因表達和調節提供了途徑。研究人員用此方法檢測了超過60,000個來自成人大腦皮層和小腦的單細胞，發現了35種不同的神經元和神經膠質細胞亞型。此外他們還將常見的人腦遺傳疾病相關的遺傳位點定位到特定的細胞類型，揭示了大腦中哪些細胞類型更易受腦部疾病遺傳因子的影響。這些發現有助于確定大腦中哪種類型的細胞最容易受到遺傳風險因子的攻擊，最終繪制一個完整的人腦細胞圖譜。

TSCS

本月，美國安德森癌癥中心的研究人員在Cell上發表”Multiclonal Invasion in Breast Tumors Identified by Topographic Single Cell Sequencing (doi:10.1016/

j.cell.2017.12.007)” 的研究性文章，發明了一種新的“地形”單細胞測序技術 (Topographic Single Cell Sequencing, TSCS)來研究細胞位置的空間信息，用于研究早期乳腺導管內原位癌 (DCIS)是如何發展為更具有侵襲性的導管癌癥 (IDC)。

腫瘤細胞往往存在著各不相同的遺傳特征，這被稱為腫瘤內異質性。它們獨特的細胞構成使得治療變得更加困難。此前的單細胞DNA測序方法已經打開了探索腫瘤細胞的大門，成為了理解腫瘤內異質性的有力工具，但是這種方法能夠去除關于個體腫瘤細胞在組織內精確空間定位的信息。而細胞空間數據對于了解腫瘤細胞的遷移至關重要。研究人員開發的新工具：“地形”單細胞測序 (TSCS) ，該方法提供了有關細胞位置的空間信息，能更準確地從空間上測量和描述單個腫瘤細胞的具體特征。這代表了一個技術上的里程碑，此前的技術只能采用失去了空間信息的懸浮細胞。

研究人員利用TSCS對來自10位具有DCIS和IDC的患者的1293個單細胞進行了分析。研究數據揭示了DCIS和IDC之間的直接基因組譜系，并進一步指出了入侵之前，在導管內發生的大多數突變和DNA拷貝數畸變。表明多個癌細胞克隆可以從導管共同遷移到相鄰區域，形成侵入性腫瘤。

TSCS和其他類似的單細胞測序方法在開發早期癌癥研究新途徑方面具有巨大的潛力。希望這些研究未來能揭示為何一些惡性腫瘤前癌沒有發展成惡性腫瘤，而另外一些則形成了侵入形式。