單細胞測序技術是指能夠在單個細胞的水平上，對基因組或轉錄組進行高通量測序分析的一項新技術。與傳統高通量測序相比，單細胞測序不僅能夠分析相同表型細胞的異質性，還能獲取難以培養微生物的遺傳信息以及珍貴的臨床樣本的信息，具有廣闊的應用前景。
細胞是生命的單位，目前大部分的基因檢測均是從組織中抽提DNA 來進行測序，得到的實驗結果往往是細胞群體中信號表達的均值，是對細胞群體進行整體表征，或者只代表其中在數量上占優勢的細胞信息，單個細胞獨有的細胞特性往往被忽略。而大量研究發現在同一器官或組織的相同類型細胞也表現出顯著的異質性，每個細胞都有其獨特的表達模式。例如實體瘤樣本的總RNA，一半以上來源于非癌細胞（成纖維細胞、淋巴細胞、巨噬細胞等），使得癌細胞的信號可能被隱藏。因此，采用均值對單個細胞進行表征是不合適的，可能會丟失許多關鍵信息。另一方面，傳統高通量測序方法，難以應用在對自然界中難培養的微生物的研究、罕見循環腫瘤細胞的轉錄組分析、胚胎發生最早期的分化特征研究、腫瘤的非均質性和微進化研究等精確程度較高的研究領域[1]。隨著細胞分選和測序技術進步，單細胞測序技術應運而生。《Nature Methods》雜志將單細胞研究方法列為未來幾年最值得關注的技術領域之一。《Science》雜志將單細胞測序列為年度最值得關注的六大領域榜首。
圖1 2008—2018年Pubmed中單細胞測序技術文獻數量變化
數據來源：Pubmed，火石創造
針對單個細胞研究時，首先將單個細胞進行分離，并確保其生物完整性不被破壞。目前常用的單細胞分離方法有連續稀釋法、顯微操作法、激光捕獲顯微切割術、拉曼鑷子技術、熒光激活細胞分選術和微流控技術等。對細胞進行溶解來獲取基因組（DNA或RNA），這步驟非常關鍵，應盡量保證基因組的完整性。目前細胞溶解的方法可以分為3大類: 物理法、化學法和生物酶降解法。由于單個細胞中的基因含量無法達到測序儀的檢測線，因此需要對基因組進行擴增，目前方法都是利用 DNA 聚合酶和不同形式的引物來進行擴增的，包括特異性的、簡并的或雜合的引物。
單細胞測序技術能夠快速確定成千上萬個細胞的精確基因表達模式，分析相同表型細胞的遺傳信息異質性。目前已應用于神經生物學、器官生長、癌癥生物學、臨床診斷、免疫學、微生物學、胚胎學、產前基因診斷等多個領域。
細胞異質性是腫瘤的重要特征。基因型異質性是指同一腫瘤內部存在具有不同基因型的腫瘤細胞，而表型異質性是指同一腫瘤內部存在具有不同基因表達譜和功能特征的腫瘤細胞。眾多科研工作者基于單細胞測序技術對腫瘤異質性進行研究，鑒定癌變細胞及癌癥發展的過程。XU等[3]對腎腫瘤進行單細胞測序，發現腎腫瘤細胞之間的突變頻率和位置不盡相同，每個細胞的突變狀態和轉錄情況也均不相同，表明腎腫瘤更加具有異質性，需要開發更加有效的細胞靶向療法。哺乳動物早期胚胎發育階段的細胞數量極為稀少，其轉錄組分析尤其需要單細胞 RNA-Seq 技術。ZHONG等[4]給予2300個妊娠胚胎人腦前額葉細胞繪制出人腦前額葉胚胎發育轉錄組圖譜，發現在發育過程中，神經干細胞、興奮性神經元細胞、抑制性神經元細胞以及星型膠質細胞、少突膠質細胞、小膠質細胞等六大類細胞占主導地位，揭示了神經元產生和環路形成的分子調控機制。組織器官發育是單細胞 RNA-Seq 技術應用的另一個重要領域。近年來陸續報道了多種組織器官(包括肺、腦、腎、血液和內耳)發育過程。由于微生物中的基因含量較低以及樣本稀少等原因，傳統的測序方法無法對難以培養的微生物進行測序。基于精確程度較高，單細胞測序技術能夠對單個微生物細胞進行測序，進而發現新的微生物，加深對微生物生命活動過程的認知。SUZANNE等[5]對某個稀有海洋微生物進行了測序，通過分析表明該微生物與硫氧化有關，進而發現了參與有氧代謝有關的基因。目前，美國、歐盟等發達國家和地區政府對單細胞測序領域投入了大量資金，用于促進單細胞測序技術的優化與各個領域的應用[6]。自2008年起，美國開始資助單細胞測序相關項目，之后一直呈現平穩增長趨勢。自2014年起，關于單細胞測序的經費數及項目數量驟增，呈爆發性增長趨勢，表明美國近幾年對單細胞測序相關項目的重視。共資助 915 個項目，累計經費 5. 39 億美元。另一方面，資助方向主要包括研究領域和應用領域，可細分為分子和細胞基礎研究，感染性疾病、腫瘤、心血管與血液病和神經精神疾病研究，再生醫學與干細胞研究，生物多樣性研究，單細胞測序相關工具、方法的建立，試劑與儀器設備的開發，資源與平臺的建立等。我國單細胞測序技術起步較晚，2010年，NSFC資助2個細胞測序相關研究項目，經費77萬元。2013
年，隨著國際對單細胞測序領域的熱度提升，NSFC 投入1500 萬元用于相關研究，2014—2015
年資助項目數及資助金額雖然稍有回落，但2016 年又迅速增加至23項，超過2000 萬元。研究領域主要包括單細胞測序儀器和技術開發、腫瘤研究與監測、胚胎發育、微生物基因組研究、醫學免疫學、干細胞研究、神經科學、在畜牧學、獸醫學中的基礎和應用研究、血液疾病等。
目前，我國 NSFC、“863 計劃”和國家重點研發計劃累計在單細胞測序領域資助經費約 1 億元，明顯低于美國不完全統計的 5.4 億美元，甚至英國的4千萬英鎊。
圖4 美國和中國對單細胞測序技術的資金投入情況
數據來源：參考文獻[6]
單細胞測序以單個細胞為單位，通過全基因組或轉錄組擴增，進行高通量測序，能夠揭示單個細胞 的基因結構和基因表達狀態，反映細胞間的異質性，在腫瘤、發育生物學、神經科學等領域發揮重要作用，正成為生命科學研究的焦點。單細胞測序技術在生物多樣性研究和細胞群體遺傳異質性研究方面具有強大優勢，將為生命科學研究人員提供全新的視角研究生命活動。我國在單細胞測序相關項目中的資助力度仍顯不足，隨著單細胞測序技術的深度和廣度逐漸加強，仍需加大對該領域的資金支持，并充分利用現有資源推動單細胞測序技術的進步與應用。
