差減cDNA文庫的建立實驗

［＋］ 和 ［-］cDNA 文庫（ATCC 或 Stratagene）

TE 緩沖液EcoRIEDTA蔗糖溶液瓊脂糖凝膠TBE 緩沖液乙醇S1 核酸酶S1 核酸酶緩沖液苯酚 氯仿 異丙醇乙酸鈉AluIRsaI去離子甲醜胺SDS酵母 tRNA氯仿 異丙醇磷酸化的 λgt10 連接臂T4 DNA 連接酶E.coli C600flAλ 噬菌體包裝抽提物懸浮介質

離心管

實驗所需「材料」、「試劑」、「耗材」具體見「其他」

1. 從［+］ 和 ［-］ 的細胞或組織獲得 cDNA 文庫。

本方案假設［＋］ 和 ［-］ 文庫是 λ 噬菌體文庫。如果這兩種文庫的載體都是質粒的話，那么它們都只需要 100 ug。插入片段需瓊脂糖凝膠電泳純化，而不僅僅是蔗糖梯度離心純化。

2. 使用大規模的 DNA 純化柱從［＋］和 ［-］ 文庫中各純化＞1 mg 的 DNA。以 1 mg/ml 的濃度重懸于 TE 緩沖液中。

3. 在 1.5 ml 的微量離心管中分別消化兩個文庫的 DNA 各 1 mg，反應如下（終體積 1.167 ml）：

1 ml 文庫 DNA （1 mg）

0.117 ml 10×EcoRI 緩沖液

0.05 ml EcoRI （1000 U）

混勻，37℃ 溫育 5 h。加入 40 ul 0.5 mol/L，pH 8.0 的 EDTA，65℃溫育 10 min 以停止反應。進行消化的時間里，在 38 ml SW-28 管子里準備 4 個 10％～40％ 的蔗糖梯度溶液。兩個管子標記為 ［＋］，兩個管子標記為 ［-］。

插入 cDNA 片段中內在的 EcoRI 位點也會被切開。如果存在這種情況的話，通過這一步獲得的部分長度的cDNA克隆可以被用來制作從起始 ［＋］ 文庫中篩選全長克隆的探針。現在有更新的克隆位點含有如 NotI 位點的載體（如 λZAP），這類載體的出現幾乎可以完全克服上述困難。

4. 每個消化產物中加入等體積的 10％ 蔗糖溶液混勻。將 ［＋］ 文庫的混勻的消化產物分成兩等份，小心地加到兩管標有 ［＋］ 的 10％～40％ 蔗糖梯度溶液上。同樣，將［-］ 文庫的DNA 消化物也加到標有 ［-］的蔗糖梯度溶液上。蔗糖梯度在 20℃ 下，122 000 g （26 000 r/min， SW-28 轉子）離心過夜（18～24 h）。

5. 用吸頭小心移除管底的 0.2 ml 組分，其余每個組分分別放入標記好的微量離心管中，保存于 4℃。

6. 每隔一個組分取 20 ul， 在用 TBE 緩沖液配制的 1.5％ 的瓊脂糖凝凝膠上分析所含的插入 DNA 片段。

7. 每管中加入 0.3 ml TE 緩沖液和 1 ml 95％ 的乙醇，混勻，置于 -20℃ 2 h 或置于干冰上 15 min， 沉淀插入的 DNA 片段。 組分中已含有沉淀 DNA 所需的足夠的 NaCl。為了能夠沉淀出 DNA，蔗糖梯度組分中的蔗糖必須要稀釋。對于低密度組分，常常需要 1～3 倍的稀釋。在高密度的組分中要高效回收 DNA ， 需要更高比例的稀釋。

8. 將沉淀溶液解凍后，用微量離心管高速離心 15 min 收集 DNA。吸出并保存上清， 一直保留到回收 DNA 被檢查確認后方可丟棄。每管加入 0.5 ml 70％ 的乙醇，再次離心，吸出上清，風干沉淀。

9. 重懸、合并來自 ［＋］ 文庫的插入 DNA 于 TE 緩沖液中，終濃度為 0.2 mg/ml。 -20℃保存。

10. 重懸、合并來自 ［-］文庫來的插入 DNA 于 100 TE 緩沖液中，置于冰上。各單獨保存一小份 400 ng 的 ［＋］和 ［-］cDNA， 用作最終文庫的評估。 從 1 mg 總的文庫 DNA 中，預期可以回收到大于 10～15 的插入 DNA。小份的 ［＋］和 ［-］ DNA 也可以用放射性標記，用作 ［＋］文庫的差異篩選探針。

11. 按如下次序混合反應體系（終體積 112 ul）， 去除 ［-］DNA 的 EcoRI 末端。

100 ul ［-］ 插入 DNA （10～15 ug）

11 ul 10 × S1 核酸酶緩沖液

1 ul 1：500 S1 核酸酶（2 U）

渦旋混勻，離心甩至管底，37℃ 溫育 30 min。

12. 加入下述試劑以終止反應：

5 ul 0.5 mol/L EDTA， pH 8.0

200 ul TE 緩沖液

300 ul 苯酚/氯仿/異丙醇

渦旋混勻，離心 1 min 分相，轉移上層水相到一個新的離心管里。加入 30 ul 3 mol/L， pH 5.2 的乙酸鈉，700 ul 乙醇。冷凍，然后按步驟 7、8 離心收集 DNA。沉淀重懸于 100 ul TE 緩沖液中。

13. 用 AluI 和 RsaI 將 S1 核酸酶處理過的 ［-］ 插入 DNA 消化成小片段。按如下次序混合反應體系（終體積 121 ul）：

100 ul ［-］ 插入 DNA （10～15 ug）

12 ul 10×AluI 緩沖液

5 ul AluI（50 U）

4 ul RsaI （60 U）

渦旋混勻，離心甩至管底，37℃ 溫育 3 h。加入 5 ml 0.5 mol/L， pH 8.0 的 EDTA， 65℃ 溫育 10 min 以停止反應。取出 5 ml 消化產物電泳檢驗。

14. 加入 200 ul TE 緩沖液和 300 ul 苯酚/氯仿/異丙醇；按步驟 12 抽提，乙醇沉淀。以 1 ug/pl 的濃度重懸于 TE 緩沖液中。

15. 用 2％ 的瓊脂糖凝膠（TBE 緩沖液中）電泳檢査 步驟 13 中的 5 ul 消化產物，EB 染色。［-］ DNA 的消化片段應當處于 50～200 bp 之間。

16. 用 ［-］DNA 片段雜交 ［＋］ 插入 DNA。在一個 0.4 ml 的微量離心管中加入如下反應體系（終體積 51 ul）

25 ul 去離子甲酰胺（50％ 的最終體積比）

10 ul［-］ DNA 片段（10 ug）

1 ul ［+］ 插入 DNA （0.2 ，ug）

12.5 ul 20×SSC （終濃度為 5×）

0.05 ul 1 mol/L NaPO₄， pH 7.0 （10 mmol/L 終濃度）

0.5 ul 0.1 mol/L， EDTA， pH 8.0 （1 mmol/L 終濃度）

0.5 ul 10％SDS （0.1％ 終濃度）

1.0 ul 10 mg/ml 酵母 tRNA （0.2 mg/ml 終濃度）

渦旋混勻，離心甩至管底，沸水浴變性 5 min。再次輕甩離心管，37℃ 溫育 18～24 h。

17. 加入 200 ul TE 緩沖液，將混合物轉移到一個 1.5 ml 的微量離心管中。用 250 ul TE緩沖液洗滌雜交管后加入雜交混合物（現在的體積是 500 ul） 加入 500 ul 苯酚/氯仿/異丙醇，渦旋混勻，離心 1 min 分相。

18. 轉移上清水相到一個新的離心管里。按上一步用 500 ul 苯酚/氯仿/異丙醇再抽提一次。加入 50 ul 3 mol/L，pH 5.2 的乙酸鈉，1 ml 乙醇，按步驟 7、8 沉淀。沉淀重懸于 12 ul TE緩沖液。

19. 連接插入 DNA 和 λgt10（不是 λgt11）噬菌體臂。混合如下反應體系 （終體積 25 ul）：

12 ul 插入 DNA

10 ul λgt10 磷酸化的臂 （10 ug）

2.5 ul 10× 連接緩沖液

0.5 ul T4 DNA 連接酶（200 U）

用吸頭上下輕輕吹吸混勻，12～15℃ 溫育過夜。

20. 準備一份新鮮的 E.coli C600hflA 的過夜培養液。第二天上午，按照廠家說明，用 8～10 個商品化的 λ 噬菌體包裝抽提物包裝步驟 19 的連接產物。

這里使用 λgt10 載體是因為當生長在合適的宿主菌中時，它可以對重組子進行選擇。10 ug λ 噬菌體載體在摩爾數上大約相當于所加入的 ［＋］ DNA的 EcoRI 末端的摩爾數。必須考慮 ［＋］ DNA 的 EcoRI 末端，即使在變性雜交后只有少部分 ［＋］ 插入 DNA 片段能被克隆。推薦的 10 ug 載體和不少于 8～10 個包裝抽提物能確保很好的文庫多樣性。

21. 包裝混合物中加入懸浮介質，一起倒入一個 5 ml 的聚丙烯管里，調整終體積到 2 ml。加入 2 滴氯仿，用手搖晃 3 s，使氯仿沉淀。

22. 按照文庫的擴增方案，取 0.2 ml 和 3 ml 新鮮的 C600hfA 菌液混合， 接種于 150 mm 的平板上，總共 10 塊。放置于 37℃ 培養過夜。

23. 第二天上午，取一塊平板計數噬斑，所得個數乘以 10 得到文庫中總得重組子。

24. 用懸浮介質洗脫板上的噬菌體或直接跳出單個噬斑篩選。

25. 評估新建的差減文庫。

最好的辦法是擴增文庫，差異篩選兩塊從單個長有 20 000～40 000 個重組子的 150 mm 平板上來的尼龍膜。一塊和總的 ［＋］cDNA 探針雜交，另一塊和總的 ［-］cDNA 探針雜交。總的［＋］ 和［-］cDNA 探針是放射性標記的第 10 步中保存的 ［＋］和［-］cDNA。大多數克隆應當能 和［＋］ 探針雜交，而幾乎沒有能和［-］探針雜交。用一種蛋白探針如 actin 或 tubulin 進行雜交是不合適的，根據多種因素推測，結果是沒有雜交發生（或只有很少）。