腺相關病毒AAV簡介及應用

一、腺相關病毒簡介

腺相關病毒（Adreno-Associated Virus, AAV）是微小病毒科（Parvoviridae）家族的成員之一。這一家族成員是一類微小、無被膜及具有二十面體結構的病毒。病毒顆粒的直徑在20～26nm之間，含有大小在4.7~6kb之間的線狀單鏈DNA基因組。它的復制和增殖依賴于輔助病毒的存在。

作為一種基因導入系統，AAV病毒載體具有安全性好，免疫原性低，能感染分裂細胞和非分裂細胞，能介導基因的長期穩定表達等優點，因此在神經系統的體內和體外研究中，受到越來越多的關注和重視。不同病毒的生物特性比較見圖1。

圖1 不同病毒的生物學特性比較

紐恩生物常用的AAV血清型有AAV1，2，5，6，7，8，9，rh10等，其中AAV2型是用的最早也是最廣泛的類型（見表1），不過因為感染范圍較窄，目前已逐漸被其他血清所替代。在這些血清型中，感染體內嚙齒類動物神經元效果最好的是AAV8和AAV9型。表1 不同血清型AAV的組織嗜親性                                                

二、AAV在神經系統中的應用

AAV病毒載體在神經系統的體內應用具有安全、高效和毒性低等優勢，非常適用于神經環路的研究。對神經環路的結構、功能和調控機制的研究是當前神經科學領域最活躍的焦點方向之一，它為深入理解神經精神疾病的發病機制，發現新的預防、診斷和治療手段提供了科學依據。神經環路研究的關鍵是精確地調控某一神經環路中特定神經元，并且還面臨著感興趣的轉基因或Floxed小鼠難以獲得，條件性基因敲除小鼠制備過程中的成本高、耗時費力。因此，利用立體定位注射技術將攜帶特定基因的AAV病毒載體注射到神經系統的特定核團，已成為神經環路研究中被廣泛應用的方法。

對于體外培養的神經元，無論是鈣轉、脂質體轉染還是電轉，都會有效率低、毒性大、必須對非成熟神經元操作以及導入的基因保持時間短等特點。以往主要用慢病毒（Lentivirus）載體向體外培養的神經元操作以及導入外源基因，但由于慢病毒載體的安全性和不能純化等缺陷，近年來，越來越多的實驗室開始嘗試AAV病毒載體感染體外培養的神經元，并發現部分類型的AAV病毒載體可以高效地感染體外培養的各階段的神經元并且毒性很低。

不管是在神經系統體內還是體外應用，AAV病毒載體既可以導入內源或外源基因的表達，又可以導入某內源基因的RNAi，干擾其表達。或者在Floxed 小鼠神經系統利用AAV病毒載體表達Cre重組酶，實現在病毒感染的細胞中敲除Floxed gene的表達。并且，在要表達的目標基因或RNAi 前面加上神經系統各種特異性的啟動子，就可以實現目標基因或RNAi在特異性神經元中的表達。特別在近年來，隨著光基因組學的快速發展，越來越多的實驗室利用AAV病毒載體向特定神經環路的神經元導入光敏感通道ChR2（Channelrho- dopsin2）、NpHR（Halorhodopsin from Natronomonas pharaonis）等，控制神經元的興奮或抑制狀態，從而研究神經環路的結構、功能和調控機制。

三、AAV應用案例介紹

案例一：AAV介導shRNA定位注射在外側韁核

結果表明：利用RNA干擾特異性地在外側韁核降低βCaMKII分子的表達可以逆轉天生抑郁大鼠模型的抑郁行為表型。
參考來源：Li K, et al Science 30 August 2013: Vol. 341 no. 6149 pp. 1016-1020  DOI: 10.1126/science.1240729

案例二  rAAV局部注射大腦皮層基因敲減實驗

參考來源：Cao et al. Nature Medicine, published online 5 May 2013; doi:10.1038/nm.3162

案例三  rAAV玻璃體腔注射表達光遺傳工具

實驗結果表明：AAV2/9型對心肌感染能力最強，成年鼠的骨骼肌易感性比幼鼠更強。利用AAV轉導GAA（酸性葡糖苷酶）到缺陷型小鼠，ECG檢查發現PR縮短。