Nature：CRISPRa截然不同的非編碼調控序列分析技術

　　來自加州大學舊金山分校的一組研究人員修改了現有的基因編輯CRISPR技術，用以來尋找增強子，他們的方法并不是編輯增強子，令其發揮作用，而是利用一種稱為CRISPRa（CRISPR activation）的工具，搜尋影響T細胞免疫細胞發育的一種基因的增強子。這項研究發現將有助于解析自身免疫疾病，如炎性腸病（IBD）和克羅恩病的病理機制。

　　這一研究成果公布在8月30日的Nature雜志上，由加州大學舊金山分校的Alexander Marson博士，以及加州大學伯克利分校的Jacob Corn博士這兩位助理教授領導完成。這兩位科研人員是隨著CRISPR技術共同成長的一批科學家，他們曾參與發表了多項CRISPR重要研究，比如Alexander Marson曾領導完成設計出了一種基于基因組編輯系統CRISPR/Cas9的新策略來精確改造人類T細胞，為開展T細胞功能研究提供了一個萬能的新工具；Jacob Corn對CRISPR-Cas9技術做出重大改進，在用一段短DNA片段替代另一段DNA時獲得了高達60%的前所未有的成功率。

　　CRISPRa開啟增強子

　　CRISPR的出現幫助研究人員在理解蛋白編碼基因方面取得了快速進展。最常用的CRISPR應用就是利用Cas9酶根據“導向RNA”指向的特殊序列剪切DNA，利用這一技術，科學家可以對任何基因進行切割或編輯，并觀察這些變化如何影響細胞或整個生物體。

　　但是直接編碼蛋白質的序列其實只占我們基因組的2％。其余98％的基因組區域屬于增強子，還有其它的調控DNA元件，這些不容易究，但又與大量遺傳疾病有關。科學家可以根據這些元件如何與結合DNA的蛋白相互作用來尋找潛在的增強子序列，然而要弄清楚哪些增強子作用于哪些基因，可以說是難上加難，一般簡單地用CRISPR-Cas9切除增強子并沒有太大幫助，因為如果這個增強子在這個實驗中使用的特殊細胞類型中不發揮作用，那么就不會有明顯的效果。

　　一個更好的辦法就是找到一個可以靶向基因組任何部分的通用“開關”，比如增強區域。這項研究就找到了——CRISPRa采用的是“減弱版”Cas9酶（能結合多個活性蛋白），雖然CRISPRa也可以通過導向RNA來靶向基因組中的精確位置，但是卻不會切割DNA，而是激活該區域中的任何增強子。

　　CRISPRa的第一個應用是通過單個導向RNA來尋找啟動子，也就是基因附近幫助基因啟動的作用元件，而通過最新這項研究，科學家們意識到CRISPRa也可以幫助他們尋找增強子，他們推測，通過將CRISPRa復合物靶向數千個不同的潛在增強子位點，即使增強子隔得十萬八千里，也可以確定是哪個增強子開啟了某個特定的基因。

　　加州大學舊金山分校的Dimitre Simeonov說：“這是從原理上來說，截然不同分析非編碼調控序列的新方法。”

　　一次進行20,000個實驗

　　研究小組選取的蛋白是IL2RA，這是一種對于T細胞免疫系統功能至關重要的作用因子。在我們人體內，T細胞能根據具體的情況，觸發炎癥或抑制炎癥。IL2RA基因的作用就是編碼蛋白，告訴T細胞是不是到時間戴上抗炎的“帽子”了，如果啟動這個基因的增強子出錯，那么細胞就不能抑制炎癥，可能導致自身免疫性疾病如克羅恩病。

　　為了追蹤控制IL2RA的增強子的位置，研究人員構建了20,000多種不同的導向RNA，然后將其放到帶有一個修飾后Cas9蛋白的T細胞中。

　　“為了能找到開啟這一基因的序列，我們可以說就是平行進行了20,000次實驗”，Marson說。

　　結果他們發現靶向CRISPRa的一些序列增加了IL2RA的表達，找到了對于調節T細胞命運具有重要意義的位點列表。

　　“每當你有機會用全新的方式提出問題時，都會突然發現用舊方法的遺漏之處，”Gowen說。

　　在炎癥疾病中利用突變增強子

　　研究人員發現其中一個增強子序列涉及能增加IBD風險的一個常見遺傳變異，不過其作用機制尚不清楚。Marson和Corn等人希望能了解這種遺傳突變是否會改變T細胞中調控IL2RA蛋白表達量的開關鍵，為此他們改變了小鼠T細胞，讓其包含有與人類疾病相關的遺傳變異，結果發現這些T細胞確實產生較少的IL2RA。

　　“這走出了解鎖免疫細胞調節的基本機制的第一步，大大增加了我們對疾病的認識，”Marson說。

　　接下來，研究人員還希望擴大該方法，一次性搜索許多不同基因的增強子，從而更快地找到免疫疾病的調節因子。他們希望這一方法能成為一種廣泛適用的工具，用于解決各種細胞中的遺傳相互作用。

　　“我們相信這將是一個非常普遍有用的方法，”Corn說，“對神經元或任何其他細胞類型感興趣的人都很容易上手，尋找與編程這些細胞行為有關的增強子。”