cDNA文庫構建

cDNA 文庫是指某生物某發育時期所轉錄的全部 mRNA 經反轉錄形成的 cDNA 片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。

經典 cDNA 文庫構建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆轉錄引物，或者用隨機引物，給所合成的 cDNA 加上適當的連接接頭，連接到適當的載體中獲得文庫。

其基本步驟包括：（1）mRNA的提純獲取高質量的mRNA是構建高質量的cDNA文庫的關鍵步驟之一。（2）cDNA第一條鏈的合成。（3）cDNA第二條鏈的合成。（4）雙鏈cDNA的修飾。（5）雙鏈cDNA的分子克隆。（6）cDNA文庫的擴增。（7）cDNA文庫鑒定評價。

 

mRNA

DTT 蒸餾水 dNTP EDTA SDS 乙醇 聚合酶 瓊脂糖 DNA聚合酶 BSA T4 DNA連接酶 酚 氯仿 異戊醇 PCR純化試劑盒

制冰機 離心機 水浴鍋 電泳儀 離心管 移液槍 培養箱

一、Superscipt II—RT合成第一鏈

1.  在一RNase-free的0.2 ml PCR管中加入x ul mRNA(大約500 ng) 、1 ul Xho I Primer(1.4 ug/ul)

(5’ GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)、11-x ul RNase-free water

（大于500 ng mRNA 分n管(500 ng/tube)合成第一鏈，第一鏈合成完畢后將n管合成一管進行第二鏈合成。）。

2.  混勻后，70℃反應10分鐘。

3.  反應完成后，立刻將反應體系置于冰上5 min。

4.  稍微離心一下，順序加入以下試劑：

（1）4 ul 5×first strand buffer

（2）2 ul 0.1 M DTT

（3）1 ul 10 mM dNTP(自己配制)

5.  混勻，稍微離心反應物之后，42℃放置2分鐘。

6.  反應完成,趁熱加入1 ul Superscipt II—RT，混勻。

7.  42℃反應50分鐘，然后70℃，15分鐘滅活反轉錄酶。

二、cDNA第二鏈的合成

1.  第一鏈反應完成后，取2ul一鏈產物-20℃冰箱中保存，待電泳檢測。其余的產物合并，混勻，然后順序加入下列試劑(promega)：

（1）20 ul 10×DNA Polymerase I buffer

（2）6 ul 10 mM dNTP(自己配制)

（3）xul dd H2O

（4）1 ul RNase H(2 U/ul)

（5）10 ul DNA Polymerase I(10 U/ul)

總體系為200 ul。

2.  混勻后，16℃反應2.5小時。

3.  70℃滅活10分鐘。

4.  反應完成后，得到200 ul cDNA第二鏈反應體系，將此體系置于冰上。

5.  取2 ul二鏈產物，同保存的一鏈產物一起電泳鑒定。同時上1kb ladder，確定雙鏈的大小范圍。

注：一鏈，二鏈的電泳圖是smear，且二鏈稍比一鏈大一些。

三、 雙鏈cDNA末端補平

1.  在第二鏈反應體系中,順序加入下列試劑(promega)：

（1）6 ul 10 mM dNTP

（2）2 ul T4 DNA Polymerase(8.7 U/ul)

（3）2 ul BSA(10 mg/ml)

2.  稍微離心混勻反應物，37℃反應至少30分鐘，然后75℃滅活10分鐘。

3.  加入等體積酚/氯仿/異戊醇,劇烈振蕩后，常溫下13 000 g離心5分鐘。

4.  離心后，吸取上清于另一1.5 ml eppendof管中，加入等體積氯仿,上下顛倒幾次混勻后，常溫下13 000 g離心5分鐘。

5.  吸取上清至另一eppendof管，加入1/10V 3M NaAc(PH5.2)和2.5 V預冷的無水乙醇,混勻，-20℃放置過夜以沉淀雙鏈cDNA。

6.  第二日，將昨日沉淀物在4℃，13 000g離心60分鐘以充分沉淀雙鏈cDNA。

7.  離心完畢，棄上清,加入1 ml 70%乙醇洗滌沉淀,常溫下13 000 g離心5分鐘。

8.  離心完畢，棄上清，干燥沉淀至無乙醇氣味。

注：第3，第4步可以用PCR 純化試劑盒代替。

四、PCR純化試劑盒操作流程

1.  溶液PE使用前應加入適量體積95%－100%的乙醇，混勻。

2.  向200 ul二鏈補平產物中加入5倍體積的buffer PB，混勻。

3.  加入spin column中，13 000 rpm離心1 min。

4.  加入0.75 ml buffer PE，13 000 rpm離心1 min。

5.  13 000 rpm，再離心1 min。

6.  將spin column放入一新的離心管中，加入50 ul buffer EB，靜置10 min。

7.  13 000 rpm離心2 min。

8.  加入30 ul buffer EB，靜置10 min。

9.  13 000 rpm離心2 min。

10.  加入1/10體積3M的NaAc，2.5倍體積無水乙醇，混勻，－20℃沉淀過夜。

五、 EcoR I adaptor 加接

1.  往雙鏈cDNA沉淀中加入9 ul EcoR I adaptor(400 ng/ul)，4℃至少放置30分鐘以充分溶解cDNA沉淀。

2.  溶解完成后,順序加入下列試劑：

（1）1.2 ul 10×Ligase Buffer

（2）1 ul 10 mM rATP

（3）1 ul T4 DNA Ligase(4 U/ul)

3.   混勻后，4℃連接3days或者8℃過夜連接。

六、 雙鏈cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切

1.  連接反應完成后,將反應體系70℃放置15分鐘滅活T4 DNA Ligase。

2.  稍微離心使反應物集中至管底，室溫下放置5分鐘,然后加入下列試劑：

（1）1 ul 10×Ligase Buffer

（2）1 ul 10 mM rATP

（3）6 ul dd H2O

（4）1 ul T4 PNK(10 U/ul)

3.  37℃反應30分鐘,然后70℃滅活15分鐘。

4.  稍微離心使反應物集中至管底。

5.  室溫放置5分鐘;然后加入下列試劑：

（1）4 ul Xho 10×Buffer

（2）2 ul BSA

（3）5ul ddH2O

（4）8ul Xho I (10 U/ul)

6.  37℃反應1.5小時,然后65℃滅活酶10分鐘。

7.  反應完成，雙鏈cDNA合成完畢。置于4℃準備回收。

七、膠回收cDNA

1.  配制小膠數板（每個樣品一板）：1%瓊脂糖凝膠，2 ul EB/300 ml 膠。

2.  取4℃保存樣品上樣，40 ul/孔。

3.  電泳50 V，1 h。

4.  紫外燈下分別切下500~1 kb、1.0-2.0 kb及2.0-4.0 kb cDNA 片段.，分別放入已做標記的1.5 ml離心管中。

5.  稱取膠重，加入三倍體積buffer QXI（例如，100 mg膠中加入300 ul buffer QXI）。

6.  50℃ 水浴數分鐘，至膠完全融化。用手指彈 QIAEX II 使重懸，每管中加入5 ul QIAEXII。

7.  50℃ 水浴10 min，每隔2 min 取出顛倒混勻數次，使QIAEX II 保持懸浮。

8.  4℃，13 000 rpm，30 s （棄上清，離心機中甩一下，吸取上清）。

9.  加入500ul buffer QXI，輕彈管底使QIAEX II 重懸。

10.  離心并去上清（同操作8）。

11.  加入500 ul buffer PE，重懸QIAEX II，離心30 s，去上清。

12.  再加入500 ul buffer PE，重懸QIAEX II，離心30 s，棄上清，離心機中甩一下，吸去上清。

13.  超凈臺上吹干（至無乙醇味），加入10 ul elution buffer，重懸QIAEX II，靜置5 min，13 000 rpm，30 s。吸上清，冰上放置。

14.  取1 ul上清上樣電泳，同時做分子量標準（1 kb ladder）及DNA含量標準（10 ng，20 ng）作對照。

15.  將收回的cDNA置于-20℃內保存，據電泳結果，取適量DNA進行連接。

1.  RNA 的提取（例如異硫氰酸胍法，鹽酸胍—有機溶劑法，熱酚法等等，提取方法的選擇主要根據不同的樣品而定）。

2.  要構建一個高質量的 cDNA 文庫，獲得高質量的 mRNA 是至關重要的，所以處理 mRNA 樣品時必須仔細小心。

3.  由于 RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗諸如煮沸這樣的物理環境，因此建立一個無 RNA 酶的環境對于制備優質 RNA 很重要。

4.   文庫構建要選擇合適的載體，常規用的是 λ-噬菌體，這是因為 λ-噬菌體 DNA 兩端具有由12個核苷酸的粘性末端，可用來構建柯斯質粒，這種質粒能容納大片段的外源 DNA。  

5.  膠回收前電泳槽，電泳板，梳子等都要用1%的HCl浸泡過夜。

6.  膠回收時電壓要穩定。

 

一、cDNA構建成功關鍵因素

1.  保證獲得數量足夠的高質量的起始RNA

構建cDNA文庫要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多，在材料允許的情況下一般的試劑盒均推薦采用純化總mRNA后進行反轉錄，這比直接采用總RNA進行反轉錄而構建的cDNA文庫好，雖然后者也并不是不能做。

老版本CLONTECH的SMART 4的中級柱子要求純化后的總mRNA量最好在0.05-0.5微克左右，這就要求起始總RNA量較多。雖然有的試劑盒聲稱少至幾十個納克的總RNA也可以構建cDNA文庫，但這是針對材料極為稀缺者而言，但起始RNA太少還是會或多或少影響文庫構建成功的風險和文庫的代表性。

至于RNA的質量，如果采用純化總mRNA后反轉錄，則對總RNA的雜質方面要求稍松，但對RNA的完整性則一絲不茍，要求未降解。如果直接采用總RNA進行反轉錄，則對總RNA的質量要求非常高，不僅要求RNA相當完整而無降解，而且要求多酚、多糖、蛋白、鹽、異硫氰酸胍等雜質少，最好是試劑盒抽提的。

2.  反轉錄成功與否及反轉錄效率是關鍵中的關鍵

這是構建cDNA文庫中最貴的一步，也是核酸質變的一步，它將易降解的RNA變成了不易降解的cDNA。反轉錄不成功，說明一次文庫方案的夭折。

反轉錄效率不高表現在一是部分mRNA被反轉錄了，但還有相當一部分本該反轉錄的mRNA未被反轉；二是只有少部分mRNA被反轉錄通了即達到帽子結構最近處，而很大一部分mRNA沒有反轉錄完全，總的全長cDNA太少，這就難以構建好的全長cDNA文庫。

少量程度的mRNA降解或反轉錄不完全在SMART 4等試劑盒及手工方法構建中對文庫的滴度影響不大，但對文庫的全長性則有很大影響。Invitrogen公司基于去磷酸化、去帽、RNA接頭連接后再反轉錄的新技術（可參考其GeneRacer說明書）從原理上是保證最終獲得全長cDNA的最好方法，但對mRNA的完整性要求非常高，理論上講必須是帶有帽子結構和Poly A結構的全長mRNA且反轉錄完全，才能進入文庫中。反轉錄完成后點樣檢測cDNA的濃度及分子量分布是很重要的。

3.  層析柱cDNA分級很關鍵

這一步稍不注意會影響成功性或影響獲得的cDNA的片段分布特點。這一步的操作要小心，尤其要在加入cDNA之前通過反復懸浮和試滴保證柱子能正常工作，cDNA的加入和收集要精力集中。

獲得的每一級的cDNA量很少，檢測時帶型很暗，所以要用新鮮做的透明薄膠檢測，根據檢測結果一定要舍棄太短的cDNA（一般400bp以下就不要了，因為短片段太多會嚴重影響后面的連接轉化效果及文庫質量）。

噬菌體文庫或質粒文庫均對載體與cDNA的連接效率要求很高，也對連接產物轉染或轉化大腸桿菌的效率要求很高。連接效率高低直接關系到文庫構建是否成功，更要注意的是文庫連接與一般的片段克隆的連接不一樣。

一般的片段克隆連接是固定長度的載體與固定長度的目的DNA連接，而文庫連接是固定長度的載體與非固定長度的目的DNA連接，目的基因cDNA長的有10kb以上，短的只有500bp或更短。

一系列長度不等的cDNA與載體在一起連接的結果，不同長度cDNA的連接效率就不一樣。有的專家的經驗是，根據分級結果，有意識地將長度不同的cDNA群分別與載體連接，再分別轉化或轉染大腸桿菌，分別完成滴度檢測，最后將不同長度級別的文庫混合在一起供雜交篩選。