為何要關注抗體藥物的糖基化修飾？

　　 在眾多的蛋白質翻譯后修飾中，糖基化修飾是最重要和最復雜的修飾之一，也是評價抗體的關鍵質量屬性之一。單抗藥物功能的實現與其糖基化修飾密切相關，糖基化修飾會影響蛋白的性能，如構象、穩定性、溶解度、藥物代謝動力學、活性及免疫原性。本文中，筆者就糖基化及其對抗體藥物的穩定性/半衰期、安全性及生物活性進行了簡要概述。

　　糖基化是蛋白質重要的翻譯后修飾之一，根據糖基化的修飾位點可將糖基化分為N位糖基化和O位糖基化。N位糖基化位于Asn-297，寡糖中的N-乙酰氨基葡萄糖與天冬酰胺殘基上的酰胺氮連接修飾蛋白，起始于內質網完成于高爾基體；O位糖基化由寡糖中的N-乙酰半乳糖與絲氨酸或蘇氨酸殘基上的羥基連接修飾蛋白，在高爾基體完成。

　　動物細胞分泌的免疫球蛋白中N位的糖基化是最普遍的糖基化修飾，同時也是研究最多的一種糖基化修飾。以IgG1為例，其重要的糖基化修飾位點位于Fc端，且根據其末端精細結構(長度、分支及單糖排列)的不同又可分為復合型、雜合型和高甘露糖型，如圖1所示。

圖1 單抗中N位糖基化的位置(左)及其三種主要類型(右)

(圖表來源于參考文獻1)

　　在圖1中可以看到IgG1的糖基化修飾為復合型，其糖基化以巖藻糖(Fuc)為核心，再由N-乙酰氨基葡萄糖(N-GlcNAc)分出兩條等長的分支，其分支上伴以甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)和唾液酸(Sia)，由此構成IgG1的Fc端N位糖基化。根據兩條分支中的單糖不同，可將IgG1的糖基化修飾類型分為表1中的不同糖型，正是由其糖型的不同導致單抗的免疫原性、生物活性、藥物動力學等的不同。

表1 IgG1的Fc端糖基化修飾類型

注：N-Acetylneuraminicacid，N-乙酰神經氨酸即為唾液酸；

表格來源于參考文獻3。

　　不同的糖基化修飾對抗體的穩定性和半衰期、安全性及生物活性具有不同的影響，下面進行一一敘述。

　　1、穩定性和半衰期

　　蛋白糖基化修飾最明顯的作用就是其可以增加蛋白的穩定性及溶解度。有研究表明，糖基化可以通過隱藏蛋白與蛋白酶的結合位點而保護蛋白。Rudd等發現，N-糖基化對鄰近多肽的位阻保護是由于糖基化與親水性氨基酸形成了氫鍵。糖基化修飾還可以阻礙蛋白酶與抗體的結合，從而增加抗體的穩定性。

　　糖基化中的唾液酸糖型可以延長血清中的糖蛋白的存在時間。當糖蛋白的糖鏈在半乳糖修飾終止時或去唾液酸化后，則其便可以被唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)識別，從而導致半衰期的大幅減少。位于肝細胞表面的ASGPR不能識別全唾液酸化的糖蛋白，但當其隨著血液循環時會被血液中的非特定唾液酸酶去唾液酸化，祼露的半乳糖糖基可以被ASGPR識別，糖蛋白被降解。還有研究稱高甘露糖型會降低血清中抗體的半衰期。

　　Junttila等的研究發現巖藻糖化對IgG1的半衰期具有影響，與正常的曲妥珠單抗相比，巖藻糖化的曲妥珠單抗的藥物代謝動力學發生了改變，從而導致其半衰期適度降低。

　　一般情況下，藥物在人體內穩定性越高、半衰期越長，則會發揮更大的效力。就抗腫瘤藥物，如果藥物穩定性較高、半衰期較長，臨床治療時的給藥量可以適當降低、給藥間隔也可設計的更長，而達到的效果一樣。但隨著藥物在人體內的穩定性及半衰期增加，由于潛在的脫靶可能，藥物的安全性也將成為需要考慮的因素之一。

　　2、安全性

　　抗體的關鍵質量屬性(CQAs)是評判其是否合格的標準，CQAs必須是在一個合適的范圍內，以保證藥物的有效性，更重要的是藥物的安全性。通過影響Fc端的效應功能，Fc端的糖基化修飾會對抗體的安全性造成影響，其表現形式為免疫原性、PK/PD(藥物代謝動力學/藥物效應動力學)等。

　　抗體的發展先后經歷了鼠原性抗體、嵌合性抗體、人源化抗體，再到最后的全人源抗體，抗體的免疫原性一直在不斷的降低。對于糖基化修飾，人體細胞專一性的合成Neu5Ac唾液酸，而其他哺乳動物細胞不僅合成Neu5Ac唾液酸，還可合成對人類具有免疫原性的Neu5Gc唾液酸。抗體生產時常用CHO細胞作為宿主細胞，而CHO細胞通常會高表達唾液酸，并且其中能引起人體免疫反應的Neu5Gc唾液酸的比例最高可達到3%。因此CHO細胞生產抗體時，如果Neu5Gc唾液酸不能安全去除則可能存在引起人體免疫反應的風險。

　　與唾液酸類似，人類細胞單一的表達β-1,4-半乳糖，而其他哺乳動物細胞還表達對人類具有免疫原性的α-1,3-半乳糖，這種α-1,3-半乳糖修飾為人類異種移植豬器官帶來了阻礙。同時，鼠科細胞第NS0和Sp2/0生產的抗體中也可能會有這種半乳糖修飾，這類抗體在使用時應嚴加控制，將其免疫原性降低在可授受范圍內。

　　抗體已經發展到全人源抗體，由糖基化修飾不同引起的免疫原性應該不再考慮。然而，為了增加抗體的功效或是延長其半衰期，往往會人為的引進某些氨基酸突變、糖基化改動等，進行這樣的改動時就需要考慮其潛在的免疫原性。并且，免疫原性不僅僅有內因，外部因素如物料、多聚體的形成、表面活性劑的引入等，均會產生免疫原性。

　　PK/PD主要考量的是藥物在體內作用的最小劑量及存在時間，對于不能完全消除免疫原性的抗體，將免疫原性控制在最低顯得尤為重要。糖基化修飾主要通過影響抗體的穩定性及半衰期進而對PK產生影響，此外，糖基化還會影響FcRn與抗體的結合進而影響藥物的PK。糖基化對抗體活性的影響作用于PD，這點將在下面的版塊中講到。研究抗體的PK/PD時有時還會引入清除率，與Fc受體結合強的抗體的清除率低，而糖基化會影響抗體與Fc受體或C1q補體的結合強度。如果抗體的清除率低，與Fc受體或C1q補體結合的抗體可能會使免疫系統攻擊正常細胞，產生嚴重的脫靶效應。

　　3、生物活性

　　腫瘤治療中，抗體發揮效力兩個重要途徑分別為抗體依賴的細胞毒性作用(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)和補體依賴的細胞毒性作用(Complement-dependent cytotoxicity，CDC)，其作用機制如圖2所示。

圖2 ADCC和CDC作用機制

(圖表來源于參考文獻2)

　　抗體的Fc端的糖基化修飾位點通常是Fc受體(ADCC機制)和C1q (CDC機制)的結合位點，通過對糖基化的調整可以增加Fc受體和C1q與抗體的結合，從而增加抗體ADCC和CDC活性。

　　很多研究中均有報道，唾液酸糖基化修飾會影響抗體與FcγRIIa的結合，從而降低抗體ADCC活性。

　　抗體的糖基化修飾中，巖藻糖被認為是影響ADCC活性最重要的單糖，去巖藻糖化可以顯著提高抗體與FcγRIIIa的親和力及ADCC活性(最高達100倍)，目前的研究還沒有發現巖藻糖化對CDC活性的影響。如圖3，Tsuguo Kubota團隊通過基因手段將CHO細胞的FUT8基因(編碼巖藻糖)敲除，生產不含巖藻糖殘基的抗體，發現其ADCC活性明顯增強。

圖3 抗體的去巖藻糖化及其對ADCC活性的作用

(圖表來源于參考文獻2)

　　相關體外研究中表明，半乳糖化可以增加抗體與補體的結合，從而增加抗體的CDC活性。此外，提高半乳糖化可以提高抗體的ADCC活性，但與巖藻糖化相比只是輔助功能，半乳糖化本身對ADCC活性的作用很小，而巖藻糖化是影響ADCC活性的主要因素。

　　另外，甘露糖化對抗體活性的影響還不是很明確。雖然Yu團隊的研究表明高甘露糖型可以明顯增加抗體與FcγRIIa的結合而增加ADCC活性，但是高甘露糖型中是不存在巖藻糖化的，所以并不能明確是高甘露糖化或是去巖藻化對ADCC活性的增強作用。

　　上面講到了不同的糖基化修飾到抗體活性的影響，那么如果Asn-297位沒有糖基化修飾呢？到目前為此，重鏈上高水平無糖基化修飾的抗體(highlevels of nonglycosylated heavy chain，NGHC)中還沒有發現其具有免疫原性，同樣也就不具有生物活性。NGHC型抗體完全失去了FcγRIII的結合能力，與C1q的結合能力也降低了10倍，從而導致該類型抗體失去了ADCC和CDC活性。此外，Ha等對比了半糖基化單抗(一條糖鏈)與完全糖基化單抗(兩條糖鏈)的生物活性，與完全糖基化單抗相比，半糖基化單抗的ADCC和CDC活性均有下降。

　　構象決定性能。糖基化修飾對抗體藥物的穩定性和半衰期、安全性及生物活性的影響是相互交叉的，將抗體的糖基化修飾控制在合適的范圍內，使三者達到平衡是最佳選擇。

　　參考文獻：

　　1.RecentAdvances in the Understanding of Biological Implications and Modulation Methodologiesof Monoclonal Antibody N-Linked High Mannose Glycans；

　　2.Engineeredtherapeutic antibodies with improved effector functions；

　　3. Fcglycans of therapeutic antibodies as critical quality attributes；

　　4.ProteinGlycosylation and Its Impact on Biotechnology。