生物樣品分析方法中基質效應的考察

LC/MSMS用于生物樣品檢測具有很高的靈敏度和選擇性，但生物樣品的基質干擾很大，基質組分有可能會干擾待測組分的質譜離子化效率，產生離子增強或抑制效應。使用MRM模式檢測的時候，色譜圖并不能反映出基質干擾對待測組分檢測的影響，因此優化色譜條件時，通過直觀的色譜圖并不能很好地考察到基質效應的影響，如果分析方法建立的時候沒有很好地考察基質效應，會對后續分析方法的重現性、線性范圍和耐受的樣品量都會有很大影響。

1.基質效應的評價方法：

文獻中評價基質效應的方法主要有兩種：

（1）空白基質處理后添加待測成分(post—extracted addition) ：這種方法是在經前處理的空白樣品基質中添加待測成分，與用流動相配制的等濃度的待測成分純溶液在相同色譜條件下分別進樣，兩者響應信號的比值，即可得到待測成分在該分析條件下的基質效應大小 。其計算公式如下：

ME=A/B*100%

A ： 在經過前處理的空白樣品基質中添加已知濃度待測成分的響應； B：等濃度待測成分純溶液的響應。

（2）柱后輸注待測成分(post—column infusion )：這種方法是進樣經前處理的空白基質樣品時，在色譜柱之后、質譜離子源之前用一恒流泵輸注適當濃度的待測成分溶液，與柱后的流出液混合后進入質譜。這樣可以很直觀地動態觀察在整個色譜分析過程中基質對待測成分響應的影響。該法的優點是可以方便地考察評價不同樣品處理方法，流動相添加物對響應的影響， 同時更有利于調整流動相洗脫程序和選擇合適的色譜柱。

2方法學驗證指導原則中基質效應的考察:

2015版中國藥典9012原則里對采用質譜方法時是需要考察基質效應的。要求使用至少6批來自不同供體的空白基質,不應使用合并的基質。如果基質難以獲得,則使用少于6批基質,但應該說明理由。

藥典中建議使用的是對于每批基質,應該通過計算基質存在下的峰面積(由空白基質提取后加入分析物和內標測得)，與不含基質的相應峰面積(分析物和內標的純溶液)比值，計算每一分析物和內標的基質因子。進一步通過分析物的基質因子除以內標的基質因子，計算經內標歸一化的基質因子。從6批基質計算的內標歸一化的基質因子的變異系數不得大于15%。該測定應分別在低濃度和高濃度下進行。

ME=(A/B)/(AIS/BIS)*100%

A :在經過前處理的空白樣品基質中添加已知濃度待測成分的響應；B:等濃度待測成分純溶液的響應;IS:內標

除正常基質外,還應關注其他樣品的基質效應,例如溶血的或高血脂的血漿樣品等。

3 減少基質效應的方法

（1）.優化前處理方法和改善色譜分離條件：

由于基質效應的產生是由與待測成分同時進入離子源的基質成分造成的，因此通過改進樣品的前處理過程，盡量除去樣品中的基質干擾成分，可顯著地降低基質效應。使用液液萃取、固相萃取等前處理方式會比蛋白沉淀方式更能降低基質效應。

采用合適的色譜分離技術，使待測成分與基質干擾組分分離，避免干擾組分與待測組分同時進入離子源，也能有效地減少基質效應的影響。一般來說，使待測成分峰后移，可以有效地避免在溶劑前沿洗脫的極性基質成分的影響。但同時應考慮色譜峰后延可能會使待測組分峰展寬及靈敏度下降。

（2）.適當添加改性劑來增強待測組分的響應或抑制基質組分的響應：

適當地添加些改性劑可以提高待測物的響應，如甲酸、乙酸、甲酸銨和乙酸銨等，同時也可以改善色譜峰形。

（3）.降低流速來提高離子化效率：

使用較低流速，在LC／MS 中，尤其在ESI模式中，流速大意味著同時進入離子源的化合物也增多。需要同時離子化的化合物增多，加劇了待測成分與基質成分在電離過程的競爭，從而使待測成分的響應降低。此外，在低流速下可產生較細的霧滴，而使霧滴的總表面積增加，待測成分與基質成分在表面積的競爭減少，從而有利于產生氣相離子，提高待測成分的信號強度。

和其他質譜離子源不同，ESI的表觀行為有如濃度型檢測器，其響應與流動相中待測成分的濃度成正 比。在流速較高的情況下，采用柱后分流，可減少進入ESI離子源的流量、降低基質效應、提高待測成分的信號強度和儀器靈敏度.

（4）.選擇合適的內標：

內標一般選用與待測成分結構相似、性質相近的化合物。其中，穩定同位素標記物是最理想的選擇，因為其可以模擬待測成分的提取和色譜、質譜行為，和待測成分有一致的保留時間，受基質成分的影響也極為相似，但待測成分與其同位素標記物在提取行為上也有可能產生極大的差異。另外，使用同位素標記物為內標需闡明存在的同位素純度、避免待測成分和內標的MS／MS監測通道間的“ 交叉干擾”以及同位素穩定性(同位素交換現象)等問題。而選擇同位素標記物作為內標的另一個缺點就是其合成比較困難，因而價格昂貴、難以獲得。當難以獲得同位素標記物為內標時，可以選用待測成分的結構類似物作為第二選擇，2015版藥典中考察的是內標歸一化后的基質效應。