生物樣品分析方法確證（二）

上周一概括了下生物樣品分析方法確證的選擇性、準確度、精密度、殘留、線性范圍、最低定量限和稀釋可靠性，剩下的回收率、基質效應和穩定性是涉及的內容比較多，或者考察方式是大家對指導原則的理解容易出現分歧的。

1.    回收率和基質效應

回收率是考察方法對待測物和內標的提取回收效率，采用液液萃取和固相萃取方法對回收率的影響比較大，回收率不要求達到100%，但需要保持穩定，不影響分析結果。

基質效應是考察基質組分存在對待測組分測定的影響，使用至少6批來自不同供體的空白基質，空白樣品處理后加入分析物和內標，對比不含基質的相同濃度的分析物和內標的峰面積，來得到基質因子，需要測定基質效應對低濃度和高濃度的待測組分的影響。

回收率和基質效應可以一起考察，需要使用至少6批空白基質（不同供體，不能混合）處理三批樣品，分別為：

A．        將待測物和內標加入到空白基質中，與樣品或質控樣品處理方法相同處理

B．         處理空白基質，處理空白基質后加入待測物和內標

C．         含待測物和內標的純溶液，使其和A與B中待測物和內標濃度的理論值相同，且盡量使其溶劑也相同

回收率為：

其中Astd為待測物峰面積，AIS為內標峰面積，括號中A和B表示為上述A、B中的樣品，下同。

基質效應：
指導原則中沒有要求同一批基質需要做的平行樣品的數量，但要求6批基質經過內標歸一化計算的基質因子的變異系數不得大于15%。除正常基質外，還應關注特殊基質，如溶血、高脂的血漿樣品。

2.    穩定性：

穩定性考察是分析方法確證非常重要的一部分，只有確保分析方法的每一步待測物都是穩定的，才能保證分析結果的準確和可靠，穩定性考察包括分析物和內標溶液的儲存穩定性、待測物和內標在基質中穩定性（短期、長期、凍融）和樣品處理后的穩定性。

a．         溶液的穩定性：考察待測物和內標的儲備液的穩定性，和工作液的穩定性，需要保證每次取用的溶液濃度都是準確可靠的。

b．         質控樣品的短期放置穩定性：考察時間可根據實際情況定，需要保證樣品從采樣到冷凍保存這個時間范圍以及樣品融化到處理的這個范圍內，待測物和內標在基質內是穩定的，考察方法是將質控樣品在室溫放置一段時間，然后與剛配制的質控品同步處理，比較待測物和內標的變化。

c．          質控樣品的長期穩定性：考察生物基質中待測物和內標在冰箱中長期儲存的穩定性，考察時間應能夠覆蓋整個檢測周期

d．         質控樣品的凍融穩定性：生物樣品一般冷凍保存，處理前需要解凍，取完樣品后需要再放回冰箱保存，所以需要考察樣品凍融過程中分析物和內標的穩定性，FDA指導原則要求需要考察至少3個凍融周期的穩定性。

e．         處理后樣品的穩定性：至少需要考察處理后樣品在自動進樣器溫度下的穩定性，考察時間必須要大于樣品處理完到檢測完成的時間，如果必要的話，還需要考察處理后的樣品放置于冰箱中的穩定性。

3.其它：

為了保證檢測結果的準確和可靠性，也有實驗室提出需要考察一個分析批能耐受的樣品數量，根據樣品分析過程中，一個分析批終檢測樣品的數量，在確證時考察不小于這個數量的質控樣品的準確度。